吴洁 崔占琴 韩瑜 李文静

1.河北医科大学第二医院口腔正畸科，石家庄 050000；2.石家庄市人民医院口腔科，石家庄 050011；3.河北医科大学第二医院口腔内科，石家庄 050000

近年来，随着人们面部审美观念及口腔健康意识的增强，成人正畸矫治比例逐年增加。但临床工作中发现，相同时间相同牵引力下大龄患者正畸过程牙移动速度较年轻患者慢，导致临床医生实施成人矫治难度增大，患者就诊周期延长。

骨保护素（osteoprotegerin，OPG）/核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear fac‐tor-κB ligand，RANKL） /核因子-κB 受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK） 系统是正畸过程中重要的破骨通路[1-2]。人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，HPDLCs） 是参与正畸骨改建的主要效应细胞[3]。HPDLCs 表达OPG、RANKL 因子[4-5]。OPG/RANKL 的比值可提示骨吸收过程的状态，比值减小时骨吸收加快；比值增大时骨吸收被抑制[6]。增龄变化是指生物体的细胞、器官随着年龄的增长发生结构退化、功能下降的一种现象[7]。本实验即通过观察不同年龄组人群HPDLCs 在体外持续静压力刺激下OPG、RANKL 的表达，探索增龄因素通过OPG/RANKL/RANK 通路对正畸压力侧骨改建产生影响的作用机制，以期为临床不同年龄段患者的正畸治疗提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

DMEM 培养基（GIBCO 公司，美国），青霉素/链霉素溶液（上海碧云天生物科技有限公司），胎牛血清（PAN 公司，德国），0.25%胰蛋白酶、PBS（BI公司，以色列），CK19（杭州华安生物技术有限公司），通用型SP试剂盒（上海中杉金桥生物技术有限公司），β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），CCK-8 试剂盒（Biosharp，合肥兰杰柯国际贸易有限公司），人OPG 酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司），人RANKL ELI‐SA 试剂盒（武汉爱博泰克生物技术有限公司）。

1.2 HPDLCs原代培养及鉴定

取自河北医科大学第二医院口腔颌面外科门诊收集因治疗需要拔除的健康离体牙，根据年龄分为 A 组 （13～18 岁）、B 组 （19～29 岁）、C 组（30～44岁）。所有纳入个体均无系统性疾病，无家族遗传疾病史。所有纳入牙齿牙周状况良好，均无龋坏，完整拔出。本实验已经河北医科大学第二医院伦理委员会批准（伦理号2021-R243），取材前均征求患者及家属同意。

手术刀片刮取离体牙根中1/3 的牙周膜，组织块法原代培养HPDLCs并传代。取第4代生长良好的HPDLCs 制备细胞爬片，苏木精-伊红（hema‐toxylin-eosin，HE）染色观察细胞形态，免疫组织化学染色鉴定细胞来源。

1.3 CCK-8检测HPDLCs增殖能力

取第4 代生长良好的HPDLCs，调整细胞密度至每毫升 2×104个，每孔 100 μL 接种于 96 孔板，置培养箱中过夜，分别于第0、1、3、5、7天使用CCK-8试剂盒检测HPDLCs增殖能力。

1.4 SA-β-Gal检测细胞衰老

将各组第4 代生长良好的HPDLCs以密度至每毫升5×104接种于6孔板中，培养箱中常规培养。待细胞长至孔底面积60%～70%，进行SA-β-Gal 染色，光镜下观察到细胞蓝染记为阳性。

1.5 HPDLCs静态加压

本实验使用HPDLCs 静态加压装置[8-9]（图1）。将定制的压强值为2 g·cm−2的圆形玻璃片置于接近铺满单层HPDLCs 的平底六孔板中，模拟正畸压力侧受力情况。

图1 体外模拟正畸压力装置Fig 1 Static mechanical pressure sketch

1.6 ELISA 检测各组 HPDLCs OPG、RANKL 蛋白表达

根据已有的年龄分组，每组又按照加力时间分为8个小组，分别给予0、1.5、3、6、12、24、48、72 h 持续静压力刺激，每个时点设3个样本，每个小组均设有空白对照，分别收集压力组及空白对照组各个时间点的细胞培养上清，ELISA 试剂盒检测各组OPG、RANKL蛋白表达。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件对实验结果进行统计分析，采用方差分析及独立样本t检验进行数据分析。检验标准为α=0.05，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HPDLCs原代培养

倒置相差显微镜下观察3 组细胞的培养情况，具体见图2。A、B、C 组细胞爬出时间为（5±2）、（7±2）、（10±3） d。A、C 组之间比较差异具有统计学意义（P<0.05），其余组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

图2 HPDLCs的培养 倒置相差显微镜 ×50Fig 2 Culture of HPDLCs inverted phase contrast microscope ×50

2.2 HPDLCs的鉴定

HE 染色观察可见：胞体为长梭形或星形，胞质嗜伊红，胞核嗜碱性（图3A）；免疫组化染色观察可见：角蛋白染色阴性（图3B），波形蛋白染色阳性（图3C），结合取材部位，判定所培养细胞为HPDLCs。

图3 HPDLCs的鉴定 ×200Fig 3 Idification of HPDLCs ×200

2.3 CCK-8检测HPDLCs增殖能力

培养7 d后A、B、C组细胞量差异有统计学意义 （P<0.01），A 组>B 组>C 组，3 组组间两两比较结果差异均具有统计学意义（P<0.05）（图4）。

图4 HPDLCs生长曲线Fig 4 HPDLCs growth curve

2.4 SA-β-Gal检测衰老HPDLCs

A、B、C 组细胞 SA-β-Gal 阳性染色率分别为2.1%±0.2%、4.2%±0.5%、7.2%±1%，3 组两两比较差异均具有统计学意义（P<0.05）（图5）。

图5 SA-β-Gal染色 × 50Fig 5 SA-β-Gal staining × 50

2.5 ELISA检测OPG、RANKL蛋白表达

空白对照组内比较可见，相同时间点OPG 蛋白表达量随年龄增长而增加（P<0.01）（表1，图6A），RANKL 蛋白表达量随年龄增长而下降（P<0.05）（表2，图6B）；压力组OPG、RANKL 蛋白浓度均随加力时间延长而增加，且OPG 蛋白表达水平随年龄增长而增加（P<0.01），RANKL蛋白表达水平随年龄增长而下降（P<0.01），OPG/RANKL蛋白比值随加力时间呈先下降后增加趋势，且随年龄增长而增加（P<0.01）（表1、2，图7）。压力组与空白对照组比较：OPG加力前后比较，A、B、C 三组差异均具有统计学意义（P<0.05）；RANKL加力前后比较，A、B、C 三组差异均具有统计学意义（P<0.01）。OPG/RANKL比值加力前后比较，A、B、C 三组差异均具有统计学意义（其中A、B组P<0.01，C组P<0.05）（图8～10）。

图7 压力组蛋白表达Fig 7 Protein expression in pressure group

图8 A组加力前后蛋白表达Fig 8 Difference of protein expression between control and pressure group in group A

表2 空白对照组和压力组RANKL蛋白表达Tab 2 The expression of RANKL in control group and pressure group

表2 空白对照组和压力组RANKL蛋白表达Tab 2 The expression of RANKL in control group and pressure group

注：组间比较：a表示与A 组比较差异具有统计学意义（P<0.05）；b表示与B 组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。空白对照组内比较：c、d、e、f、g分别表示同组内与6、12、24、48、72 h比较差异具有统计学意义（P<0.05）。压力组内比较：A组组内除0 h与1.5 h比较外，其余各个时间点两两比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；B 组组内除0 h与1.5 h、48 h与72 h比较外，其余各个时间点两两比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；C 组组内除0 h 与1.5 h、24 h 与12 h、24 h 与48 h 比较外，其余各个时间点两两比较，差异均具有统计学意义（P<0.05）。

C组0.233 6±0.016 9 0.647 8±0.187 9 1.503 2±0.159 6a 2.857 8±0.515 2a 5.052 6±0.701 2a 5.390 3±0.992 6ab 6.185 1±0.376 6ab 7.182 3±0.722 1ab加力时间/h 0 1.5空白对照组压力组B组0.266 4±0.016 9cdefg 0.314 7±0.044 2cdefg 0.493 1±0.024 0defg 0.848 2±0.226 2 1.350 8±0.254 4ef 2.482 7±0.664 0cdf 2.759 4±0.334 9cd 3.289 7±0.611 0cdef B组0.239 6±0.011 6 0.870 8±0.073 0 1.867 6±0.175 5 3.396 0±0.787 2a 5.515 7±0.891 5a 6.458 1±0.402 6a 7.546 9±0.854 6a 8.386 9±0.291 8a 3 6 1 2 C组0.284 1±0.016 9defd 0.306 8±0.066 3defg 0.458 8±0.053 1defg 0.775 5±0.257 1 1.195 9±0.242 9 2.140 1±0.337 1cd 2.595 9±0.223 5acd 2.952 0±0.453 0cde A组0.272 8±0.016 9cdefg 0.340 4±0.026 6cdefg 0.533 8±0.059 7defg 0.908 6±0.159 6 1.6608±0.267 0cef 2.620 5±0.597 2cdf 3.109 3±0.434 9cd 3.425 3±0.342 4cde A组0.278 3±0.015 2 0.948 5±0.011 7 2.580 0±0.099 4 4.749 3±0.138 3 6.893 3±0.754 3 8.889 2±0.714 8 10.003 4±0.864 6 11.602 8±0.768 5 24 48 72

图6 空白对照组蛋白表达Fig 6 Protein expression in control group

表1 空白对照组和压力组OPG蛋白表达Tab 1 The expression of OPG in control group and pressure group

表1 空白对照组和压力组OPG蛋白表达Tab 1 The expression of OPG in control group and pressure group

注：组间比较：a表示与A 组比较差异具有统计学意义（P<0.05）；b表示与B 组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。空白对照组内比较：除A 组组内0 h 与1.5 h 比较外，A、B、C 三组组内其他时间点两两比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；压力组内比较：A、B、C三组组内各个时间点两两比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。

压力组C组5.414 9±0.584 3 16.026 6±0.229 2 31.461 7±0.496 7 40.096 1±0.740 6a 97.437 3±1.609 0ab 133.845 6±1.492 3ab 174.224 2±1.938 0ab 235.264 5±2.483 3ab加力时间/h B组5.393 2±0.339 6 15.608 5±0.947 9 30.479 7±0.455 6 38.826 7±1.991 5a 92.129 1±1.517 5a 124.568 2±3.128 9a 169.217 1±2.799 3a 229.489 3±1.606 0a A组5.572 0±0.347 4 7.866 4±0.976 6 12.771 9±0.754 20.153 3±1.967 5 37.565 4±1.529 6 59.576 6±1.804 9 73.786 7±2.926 9 84.806 0±1.875 5空白对照组B组5.845 4±0.445 1 8.499 1±0.962 6 14.372 8±0.516 0 23.958 3±1.044 7a 40.235 7±1.711 2a 65.217 5±1.443 9a 77.833 1±1.850 0a 90.283 1±1.679 8a C组5.521 6±0.196 9 9.899 7±0.843 3 15.606 0±0.605 0a 25.938 6±1.3967 a 42.015 8±1.996 7a 71.085 0±1.644 1ab 80.485 9±1.644 3ab 96.120 2±1.436 2ab A组5.571 4±0.179 6 15.221 4±0.714 3 29.084 1±0.930 4 33.594 7±1.175 3 89.030 9±1.384 9 118.093 8±1.172 1 162.248 3±3.692 5 224.321 6±1.799 0 0 1.5 3 6 1 2 24 48 72

3 讨论

近年来研究提示，成人正畸出现的牙槽骨吸收、牙齿移动迟缓现象，可能与机体增龄因素引起牙周组织OPG、RANKL 表达水平的变化有关。Kawasaki 等[10]通过监测正畸牙移动168 h 期间青少年与成人的牙齿移动量差异并采用ELISA 法测定龈沟液中OPG、RANKL 表达的差异，发现青少年龈沟液中的OPG/RANKL 比值低于成人，青少年的牙齿移动量大于成人。刘艳等[11]构建了大鼠正畸实验模型，免疫组织化学检测了牙周组织内RANKL 表达变化，结果表明与成年鼠相比，相同力值作用下早期幼年鼠RANKL表达量较高，牙齿移动速度较快。

George 等[12]对成年人及青少年临床加载大小相当的正畸力，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法检测正畸牙移动第7、14、28 天牙周组织中细胞因子表达，结果表明除第28天成年人OPG 表达较高外，其余时间青少年OPG、RANKL 表达强于成年人。以往研究多为构建动物模型或临床直接获取正畸患者龈沟液检测不同年龄段OPG、RANKL表达差异。

以往研究显示压力刺激可影响OPG、RANKL蛋白的表达水平，引起OPG/RANKL比值变化，从而导致正畸压力侧骨吸收。张瑞林等[13]通过21 d连续监测大鼠压力侧牙移动距离、Micro CT 观察牙槽骨变化，免疫组织化学染色压力侧牙周组织切片，发现随加力时间延长大鼠正畸牙压力侧RNAKL和OPG蛋白表达水平先增加后降低，破骨细胞数目增加，移动距离逐渐增大。RANKL、OPG 表达呈现时序性特征变化，即受压后RANKL表达较早出现增加，随之OPG 表达增加，OPG 表达高峰出现在RANKL 表达高峰之后。柏思羽等[14]体外对牙周膜细胞施加机械压应力，PCR 测定OPG、RANKL 表达发现压力刺激后OPG 表达下降，RANKL 表达上升。本研究发现压力加载后，OPG、RANKL 蛋白表达较空白对照组增加；RANKL 蛋白表达随加力时间延长而增加；OPG 蛋白水平在0～6 h 缓慢增加，6 h 之后表达量增长幅度较大；OPG/RANKL 比值先下降后增加。认为OPG/RANKL 比值的变化是通过RANKL、OPG 蛋白表达的时序性特征实现，RANKL 蛋白较早的反应导致压力侧的OPG/RANKL 比值下降，形成正畸压力侧骨吸收。此后OPG 蛋白通过机体一系列信号转化后形成增加，OPG/RANKL比值较之前有所增长，骨吸收减缓，直至比值逐渐接近空白对照组，重新恢复骨平衡，与张瑞林等[13]的研究结果相似。压力作用下OPG 的表达变化以往研究未见明确结论，本研究发现压力刺激可导致OPG 蛋白表达水平逐步升高，认为OPG 表达的增加作为一种负反馈机制，更好地维持压力侧骨改建平衡有积极意义。为保证加力过程中细胞状态良好、实验结果客观，本研究将最长加力时间设置为72 h。后续实验将考虑延长加力时间，深入探讨压力刺激对HPDLCs表达OPG、RANKL的影响。

图9 B组加力前后蛋白表达Fig 9 Difference of protein expression between control and pressure group in group B

本研究主要关注增龄因素可否通过直接对HP‐DLCs 表达OPG/RANKL/RANK 通路相关蛋白水平产生影响，从而影响压力侧骨吸收。已有研究证明增龄因素可影响OPG/RANKL/RANK 通路相关蛋白表达。本研究显示，空白对照组HPDLCs 的OPG 蛋白表达量随年龄增长而增加，RANKL 蛋白表达量随年龄增长而下降。本研究涉及离体牙供体年龄为13～44岁，后续试验考虑扩大受试者年龄范围，增加性别分组，以更全面地观察增龄因素对OPG、RANKL表达的影响。

图10 C组加力前后蛋白表达Fig 10 Difference of protein expression between control and pressure group in group C

目前体外分离培养HPDLCs 的技术已经基本成熟，常见的培养方法有组织块法、酶消法、酶消组织块法等。但随供体年龄增长，细胞培养难度增加、成功率下降。本研究收集培养13～44 岁HPDLCs，均获得成功，可能与培养细胞时采用高浓度血清及使用刀片刮取获得的组织块较小有关。1）本实验采用组织块法体外分离培养HPDLCs，刀片小块刮取根中1/3 的HPDLCs，既能防止酶消法对细胞的损伤，又能避免后期对组织的剪切，使培养出的细胞更具生物活性。2）本研究培养所用完全培养基含20%体积分数胎牛血清，较高浓度血清利于细胞生长。3）刀片刮取牙周膜组织体积较小，原代培养当天加入1 mL 培养液置于培养箱中常规培养，使组织较好贴壁。48 h 后轻柔换液，加入2 mL 培养基，此后3～5 d 换液，避免经常移动观察。待细胞爬出再加入3～5 mL 培养液，2 d定期换液以保证细胞生长状态良好。

体外细胞实验模拟正畸压力可选用静压力、剪切力等多种类型。本研究采用2 g·cm−2顶-底轴单向持续静压力对HPDLCs 直接加压[8-9]，力值容易控制细胞受力均匀。以往研究[15-16]表明此力值无细胞毒性，细胞活性较佳。持续静压力装置加力期间不改变细胞生长所需环境，以保证加力期间细胞状态良好，较客观模拟临床正畸过程牙周膜参与压力侧骨改建的过程。

本研究对所获得的不同年龄组的HPDLCs 给予体外持续静压力刺激进行干预，通过ELISA 法检测OPG、RANKL 的表达，从而推测增龄因素对正畸治疗过程中骨改建的影响。实验结果证明，压力刺激后相同时间点RANKL蛋白表达随年龄增长而下降，OPG 蛋白表达随年龄少量增加，OPG/RANKL 比值随年龄增长而增加。提示体外持续静压力下增龄因素可调控HPDLCs 的OPG、RANKL蛋白表达。

OPG 为分泌型蛋白，RANKL 包括分泌型、膜结合型两种。ELISA 检测细胞培养上清只代表分泌型蛋白表达。本课题目前仅限于实验室分子生物学范畴的研究，存在一定局限性。后续将进一步深入研究增龄因素对HPDLCs 蛋白表达水平的影响及体内作用机制，探讨可否通过局部或全身应用RANKL 或OPG 调控临床成人正畸牙齿移动速度。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。