王新乐，白俊艳，2，*，李静云，雷 莹，2，李 淦，2，庞有志，2，董智豪，陈 宇，樊红灯，王龙威，陈梦柯，曾凡林，安肖凯，白永振

(1.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023； 2.洛阳市动物遗传育种重点实验室，河南 洛阳 471023)

血管活性肠肽Ⅰ型受体(vasoactive intestinal peptide receptor-1，VIPR-1)是VIP蛋白受体家族成员之一，具有大的亲水性细胞外N端和7个高度保守的疏水性跨膜螺旋以及细胞质C端[1]。VIPR-1是血管活性肠肽(VIP)与垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)的共同受体，通过介导VIP和PACAP发挥生物作用，对动物的繁殖和生长具有重要的调节作用[2]。VIPR-1基因是影响家禽繁殖性能的重要候选基因。李雨顺等[3]研究表明，VIPR-1基因的突变显著影响鸡的产蛋性能。朱志明等[4]研究表明，VIPR-1基因对240日龄产蛋数和300日龄产蛋数存在显著影响(P<0.05)。周敏等[5]研究表明，清远麻鸡VIPR-1基因的C1704887T位点对总产蛋数与总正常蛋数存在显著影响(P<0.05)。Pu等[6]研究结果表明，VIPR-1基因多态性对鹌鹑蛋重具有明显的影响。可见，VIPR-1基因在家禽生长发育过程中有着极为重要的作用。

鹌鹑根据其饲养环境不同，被分为野生鹌鹑和家养鹌鹑；根据其用途又可分为商品鹌鹑和实验用鹌鹑；按经济用途可分为蛋用鹌鹑和肉用鹌鹑。鹌鹑因体型小，饲养周期短，营养价值高，繁殖能力强等优点，具有广阔的发展前景[7]。鹌鹑的新陈代谢活动快，对光敏感，抗病力强，便于作为实验材料对其一些基因及生长性状进行相关研究。本实验以法国巨型肉用鹌鹑和莎维麦脱肉用鹌鹑为研究对象，采用PCR-RFLP方法分析肉用鹌鹑VIPR-1基因的遗传多态性，并与鹌鹑胴体性状进行关联分析，旨在为肉用鹌鹑的标记辅助选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与性状测定

本研究所用实验动物是莎维麦脱肉用鹌鹑36只和法国巨型肉用鹌鹑49只，从2周龄饲养到5周龄，每个鹌鹑活体翅下采集1 mL血液，利用禽类全血基因组DNA提取试剂盒(郑州鼎国生物有限公司提供)提取DNA。在第5周龄肉用鹌鹑饲养试验结束后，使用颈动脉、颈静脉放血的方法处死并褪毛后再解剖，分别用电子天平称取各个部位质量，测定的屠宰性状包括活重(g)、屠体重(g)、全净膛重(g)、心重(g)、肝重(g)、胸肌重(全)(g)、腿肌重(单)(g)。具体测定方法参照NY/T823—2004规定的要求进行。

1.2 VIPR-1基因的引物合成

VIPR-1基因的引物信息来自蒲跃进[8]，实验共设计2对引物即VIPR-l-E4-E5和VIPR1-E6-E7(分别命名为BsrDⅠ位点、HpyCH4Ⅳ位点)，引物的具体信息见表1，引物由武汉奥科生物科技有限公司合成。

表1 鹌鹑VIPR-1基因引物序列信息

1.3 PCR扩增及产物检测

PCR扩增反应体系的总体积15 μL，包括：去离子水5.3 μL，2×TaqPCR Mix 7.5 μL，DNA模板1 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性35 s，54 ℃(BsrDⅠ位点)/58.7 ℃(HpyCH4Ⅳ位点)退火35 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。

1.4 PCR-RFLP分析

限制性内切酶BsrDⅠ为VIPR-l-E4-E5引物扩增的PCR产物进行酶切，酶切反应体系为10 μL：ddH2O 1.0 μL，PCR产物7.5 μL，限制性内切酶BsrDⅠ(5 U·μL-1)0.5 μL，l×buffer 1.0 μL。混合均匀瞬时离心后，置于37 ℃恒温培养箱消化过夜。限制性内切酶HpyCH4Ⅳ为VIPR-l-E6-E7引物扩增的PCR产物进行酶切，HpyCH4Ⅳ酶切反应体系为10 μL：ddH2O 1.0 μL，PCR产物7.5 μL，限制性内切酶HpyCH4Ⅳ(10 U·μL-1)0.5 μL，1×buffer 1.0 μL。混合均匀瞬时离心后，置于65 ℃恒温培养箱1 h。酶切产物采用1.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳结束后利用凝胶成像系统拍照记录。

1.5 数据的统计分析

利用Excel和SPSS分析软件对所测得的数据进行合并整理，利用Dispan 软件计算出VIPR-1基因的基因频率，基因型频率，杂合度(He)，有效等位基因数(Ne)，多态信息含量(PIC)，以及所测群体的该基因进行哈代温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)检验。利用SPSS等软件对VIPR-1基因与肉用鹌鹑胴体性状进行关联分析，分析模型为：yijk=μ+Si+Mj+eijk，其中，yijk是表型测定值，μ是总体均值，Si是第i个性别效应，Mj是第j个基因型效应，eijk是残差效应。

2 结果与分析

2.1 鹌鹑VIPR-1基因的PCR产物检测

鹌鹑VIPR-1基因的BsrDⅠ位点和HpyCH4Ⅳ位点的PCR扩增的产物结果见图1，可以看出，目的条带大小分别为925 bp和1 096 bp，结果条带的大小与产物预期的一致，表明PCR产物质量合格。

M，Marker DL2000；1-2，法国巨型肉用鹌鹑；3-4，莎维麦脱肉用鹌鹑。M，Marker DL2000；1-2，French giant meat quail；3-4，Savimaito meat quail.图1 鹌鹑VIPR-1基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis test for PCR products of VIPR-1 gene of quail

2.2 鹌鹑VIPR-1基因BsrDⅠ位点和HpyCH4Ⅳ位点的多态性检测

鹌鹑VIPR-1基因外显子4-5的BsrDⅠ位点和外显子6-7的HpyCH4Ⅳ位点的PCR产物经BsrDⅠ和HpyCH4Ⅳ酶切后产生GG(925 bp)、TT(315 bp/643 bp)和GT(315 bp/643 bp/925 bp)；GG(1 096 bp)、AA(285 bp/811 bp)和AG(285 bp/811 bp/1 096 bp)各3种基因型，具体见图2。

M，Marker DL2000；1、2、7，GT基因型；3、4、6，GG基因型；5，TT基因型；8，AA基因型；9、11，GG基因型；10、12，AG基因型。M，Marker DL2000；1， 2， 7，GT genotype；3， 4， 6，GG genotype；5，TT genotype；8，AA genotype；9， 11，GG genotype；10， 12，AG genotype.图2 鹌鹑VIPR-1基因的BsrDⅠ(A) 和HpyCH4Ⅳ(B)的多态性检测Fig.2 Polymorphism detection of BsrDⅠ (A) and HpyCH4Ⅳ (B) of VIPR-1 gene of quail

2.3 鹌鹑VIPR-1基因的群体遗传多态性

鹌鹑VIPR-1基因BsrDⅠ位点和HpyCH4Ⅳ位点的基因型频率及等位基因频率的统计结果见表2和表3，在BsrDⅠ位点，两个群体中均可检测出GG、GT、TT 3种基因型，均以GT基因型频率为最高。在HpyCH4Ⅳ位点，两个群体中均可检测出AA，AG和GG 3种基因型，两个群体均以GG基因型频率为最高。莎维麦脱肉用鹌鹑和法国巨型肉用鹌鹑中均以G等位基因为优势等位基因，G等位基因频率分别为0.889和0.969。

表2 VIPR-1基因的BsrDⅠ位点的基因型频率和等位基因频率

表3 VIPR-1基因的HpyCH4Ⅳ位点的基因型频率和等位基因频率

BsrDⅠ位点在莎维麦脱肉用鹌鹑和法国巨型肉用鹌鹑中的多态信息含量分别为0.372和0.350，均为中度多态(0.250.05)；HpyCH4Ⅳ位点的3种基因型在莎维麦脱肉用鹌鹑中显著偏离哈代温伯格平衡(P<0.05)，在法国巨型肉用鹌鹑中极显著偏离哈代温伯格平衡(P<0.01)。

2.4 鹌鹑VIPR-1基因多态性与胴体性状的关联分析

鹌鹑VIPR-1基因的BsrDⅠ位点和HpyCH4Ⅳ位点与胴体性状关联分析结果见表4和表5，由表4可以看出，法国巨型肉用鹌鹑中，BsrDⅠ位点的TT基因型肝重显著高于GT基因型(P<0.05)，GG基因型的肝重与TT和GT基因型无显著差异(P>0.05)；除此之外，BsrDⅠ位点与其他胴体性状无显著相关性(P>0.05)；BsrDⅠ位点与莎维麦脱肉用鹌鹑的体重、屠宰重、全净膛重、心重、肝重、胸肌重、腿肌重、屠宰率、全净膛率、心比率、肝比率、胸肌率和腿肌率无显著相关性(P>0.05)。

表4 鹌鹑VIPR-1基因的BsrD I位点的多态性与胴体性状的关联分析

由表5可以看出，法国巨型肉用鹌鹑中，HpyCH4Ⅳ位点的AG基因型的体重、屠宰重和肝重显著高于AA、GG基因型(P<0.05)，而AA基因型的体重、屠宰重和肝重与GG基因型差异不显著(P>0.05)，除此之外，该位点与其他胴体性状无显著影响(P>0.05)；莎维麦脱肉用鹌鹑中，HpyCH4Ⅳ位点的AA基因型的体重、屠宰重、全净膛重、心重、胸肌重、腿肌重显著高于GG基因型和AG基因型(P<0.05)，GG基因型的体重、屠宰重、全净膛重、心重、胸肌重、腿肌重显著高于AG基因型(P<0.05)。AG基因型的肝比率显著高于GG和AA基因型(P<0.05)。AA基因型的胸肌率显著高于AG基因型(P<0.05)。除此之外，该位点与其他胴体性状无显著相关性(P>0.05)。

表5 鹌鹑VIPR-1基因的HpyCH4Ⅳ位点与胴体性状的关联分析

3 讨论

3.1 VIPR-1基因的多态性分析

VIPR-1基因的多态性在不同畜禽中均有报道，蒲跃进[8]研究表明，神丹公司的H系、L系鹌鹑和河南南阳的野生鹌鹑3个鹌鹑群体的VIPR-1基因的BsrDⅠ酶切位点和HpyCH4Ⅳ酶切位点检测到的突变与本实验结果相似。朱志明等[4]研究河田鸡VIPR-1基因发现，外显子2的HpaⅡ位点存在AA、AG和GG 3种基因型。辛清武等[9]研究表明，黑番鸭的VIPR-1基因内含子12的StuⅠ酶切位点处发现一个基因突变，产生了3种基因型AA、AG、GG。李德娟等[10]研究表明，太行鸡的VIPR-1基因的内含子1中发现8个SNP位点。Zhou等[11]在红原鸡等鸡品种中测出VIPR-1基因上的11 136 bp区域发现了128个变异位点，包括109个SNP和19个其他变异，VIPR-1基因具有很强的多态性，在不同物种的VIPR-1基因也对生物体产生各种影响，为我们研究VIPR-1基因奠定了理论基础[12-14]。

3.2 VIPR-1基因与生产性能的关联分析

周敏等[15]研究表明，在优质肉鸡宁都三黄鸡群的VIPR-1基因座在3个位点分别为位于5′调控区的位点A-284G、位于内含子6的位点C+42913T和位于内含子8的位点C+53327T，不同基因型会对其早期产蛋性状产生显著影响。周敏等[16]研究表明，宁都三黄鸡的VIPR-1基因中内含子2和内含子8的突变基因对其体重具有一定影响。洪军等[17]研究表明，如皋黄鸡的VIPR-1基因的PA位点与PB位点上的不同基因型对如皋黄鸡的产蛋性能具有显著影响，在产蛋性能方面，TTTC和GTTT组合基因型个体的组合效应显著。蒲跃进[8]研究表明，VIPR-1基因的两种突变G373T和A313G，发现两个突变位点形成的基因型与鹌鹑繁殖性能之间存在关联，不同单倍型个体与所用实验鹌鹑的20周蛋重、20周龄产蛋数之间均存在相关性，且差异显著(P<0.05)。由于基因具有一因多效的功能，而本研究发现两种肉用鹌鹑的VIPR-1基因的BsrDⅠ位点和HpyCH4Ⅳ位点与鹌鹑胴体性状也存在相关性，且差异明显(P<0.05)。周敏等[18]探究清远麻鸡VIPR-1基因对其生长性状的影响，结果表明，该基因位点C+53327T与该鸡品种300日龄的体重呈极显著相关(P<0.01)，其中CT基因型个体300日龄体重显著高于CC和TT基因型个体。朱志明等[4]发现，河田鸡的VIPR-1基因外显子2的HpaⅡ位点存在AA、AG和GG 3种基因型，等位基因G所对应的河田鸡群体的产蛋数和蛋重均高于等位基因A。周敏等[19]研究表明，在红色原鸡、清远麻鸡、杏花鸡、白来航鸡群体以及白耳黄鸡的VIPR-1基因外显子l发现了多态位点A1661979G，有AA、AG和GG 3种基因型，位点A1661979G会导致VIPR-1前体蛋白的信号肽序列发生改变(Asn→Ser)，对清远麻鸡的就巢性状产生显著影响。董智豪等[20]在3种蛋用鹌鹑的VIPR-1基因外显子6-7区域共检测出15个SNP位点，只有A355G位点可以被酶切分型。A355G位点与中国黄羽鹌鹑的日增重、体重、胫长、胸宽、胸深、胸骨长、胫围有显著相关性(P<0.05)，与中国白羽鹌鹑的胫围有显著相关性(P<0.05)，与朝鲜鹌鹑的体重、胸宽、胸深有显著相关性(P<0.05)。本研究表明，VIPR-1基因外显子4-5的BsrDⅠ位点与法国巨型肉用鹌鹑的肝重有显著相关性(P<0.05)；VIPR-1基因外显子6-7的HpyCH4Ⅳ位点与法国巨型肉用鹌鹑的体重、屠宰重、肝重有显著相关性(P<0.05)，与莎维麦脱肉用鹌鹑的体重、屠宰重、全净膛重、心重、胸肌重、腿肌重、肝率、胸肌率有显著相关性(P<0.05)。VIPR-1基因可以作为候选基因应用于肉用鹌鹑的分子标记辅助选择。