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一株牦牛源牛病毒性腹泻病毒毒株的分离鉴定及其遗传特性分析

2022-11-28王慧慧冯茜莉汪梦竹赵泽阳李易聪蒲飞洋龚真莉马忠仁马晓霞

浙江农业学报 2022年11期
关键词:密码子同义毒株

王慧慧,冯茜莉,汪梦竹,赵泽阳,李易聪,蒲飞洋,马 鹏,李 勇,龚真莉,马忠仁,马晓霞,*

(1.西北民族大学 生物医学研究中心,甘肃 兰州 730030; 2.西北民族大学 生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730010;3.中国农业科学院 兰州兽医研究所,甘肃 兰州 730046)

牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员。猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)和羊边界病病毒(Borderdiseasevirus,BDV)也是该病毒属的成员[1]。BVDV是一种具有囊膜的单股正链RNA病毒,根据BVDV抗原性和基因组5′-UTR(5′-非翻译区)序列的差异,可将BVDV分为BVDV-1(基因1型)、BVDV-2(基因2型)和BVDV-3(基因3型)共3种基因型,其中,BVDV-1型包含23个基因亚型,即BVDV-1a—BVDV-1w,BVDV-2型可分为BVDV-2a、BVDV-2b、BVDV-2c和BVDV-2d共4种基因亚型[2-3]。BVDV-1型的感染发生在世界各地,主要涉及呼吸、生殖和肠道器官,导致病牛发热、腹泻,给养牛业造成威胁。BVDV-2型最早发现于北美,现在世界各地都有感染,能引起与BVDV-1相似的临床症状。牛若感染毒力较高的BVDV-2分离株,会引发血小板减少和致死性出血综合征[4]。根据接种毒株后的细胞是否产生细胞病变,可将BVDV分为致细胞病变型(cytopathic,CP)和非致细胞病变型(noncytopathic,NCP)2种生物型,这两种生物型可以通过基因突变进行转化。CP型毒株在感染细胞后,会引起细胞死亡、变圆、聚集成堆,细胞逐渐缩小、脱落,最终漂浮在维持液中,活细胞则在瓶壁上呈拉网状[5]。母牛在妊娠早期感染NCP型BVDV会导致小牛出生存活后出现持续性病毒血症,成为持续感染(persistent infection,PI)的小牛,即PI牛[6]。PI牛生长缓慢,而且用PI牛生产的血清来培养细胞或生产疫苗等生物制品时极有可能污染培养的细胞和生产的生物制品,同时,PI牛持续排出的病毒也可导致BVDV在畜群中传播[7];因此,鉴定并剔除PI牛在牛病毒性腹泻病(bovine viral diarrhea,BVD)的防控中具有重要意义。

BVDV基因组全长12.3~12.5 kb,包括5′-UTR、3′-UTR(3′-非翻译区)和一个单独的开放阅读框(open reading frame,ORF)[8]。该ORF的基因组编码一个大的多聚蛋白,包含4个结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8个非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。ORF编码病毒蛋白的顺序依次为NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH[9],其中,Erns、E1和E2是包膜蛋白,E1和E2可形成异二聚体,并通过一段疏水氨基酸残基延伸镶嵌在细胞膜上,而Erns不能直接镶嵌在细胞膜上,但可通过一个独特的C-末端结构域与外膜相互作用,并且被分泌到细胞质基质中[10]。区分NCP与CP两种生物型BVDV的重要依据是,与NCP型BVDV相比,某些CP型BVDV在NS2—NS3区域含有额外的序列。8种非结构蛋白的形成与BVDV自身的丝氨酸蛋白酶有关,在病毒的复制、转录和翻译中起重要作用,其中,NS2—3在复制过程中发挥着重要作用[11-12]。虽然以E2蛋白为基础研发疫苗可诱导机体产生中和抗体,但是由于突变更倾向于集中在结构蛋白,特别是E2蛋白的编码区,其变异率较高[13]。

深入探索、了解牛群的BVDV流行情况和PI动物的比率,有助于预防和控制牛病毒性腹泻-黏膜病(bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)的发生,对制定合理的疫苗接种计划亦具有至关重要的作用。我国西北地区是世界牦牛的主要产区之一。近年来,BVD在我国西北地区呈现蔓延趋势,严重影响了规模养牛业的持续健康发展[14-15]。为此,本研究拟采集该地区的牦牛血清,进行病原分离、鉴定,并扩增分离病原的基因组序列,以期摸清当地BVDV的流行现状及其分子进化规律。研究结果有望对防控BVD和深入了解BVDV在我国西北地区牦牛群中的生态学分布发挥积极作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 牦牛血清和细胞系

用于血清中BVDV分离的牛肾细胞(MDBK)由作者所在实验室保存。采自我国西北地区的牦牛血清样品由作者所在实验室保存。

1.1.2 主要试剂

DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶,均购自兰州民海生物工程有限公司;RNAprep Pure高效总RNA提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;一步法RT-PCR试剂盒,购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;DNA分子质量标准(DL2000),购自宝日医生物技术(北京)有限公司;PBS缓冲液和50×TAE缓冲液,购自北京索莱宝科技有限公司;琼脂糖,购自上海桥星贸易有限公司。

1.1.3 主要仪器

MTX 150型微量超速离心机,美国Thermal;3111型CO2恒温培养箱,美国Thermal;K960型梯度PCR仪,力新仪器(上海)有限公司;DYCP-31CN型琼脂糖水平电泳仪,北京六一生物科技有限公司;WD-9413C型凝胶成像系统,北京六一生物科技有限公司;HT7700型透射电镜,日本Hitachi;DW-86L386型超低温冰柜,海尔集团。

1.2 方法

1.2.1 BVDV检测引物设计

根据GenBank已公布的参考序列,应用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性引物(F,5′-CTCTGCTGTACATGGCACAT-3′;R,5′-GAGCAGCTKGTGACCCATAR-3′),送西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成,预期片段大小约为500 bp。

1.2.2 反转录PCR(RT-PCR)检测

参照RNAprep Pure高效总RNA提取试剂盒的说明书提取血清总RNA,利用一步法RT-PCR试剂盒与设计好的引物,用RT-PCR扩增Npro片段。50 μL反应体系如下:2×One Step Mix(Dye Plus)25 μL,One Step Enzyme Mix 2.5 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL,RNA 5 μL,补水至50 μL。反应程序:50 ℃反转录30 min;94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃延伸7 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,阳性样品由西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行序列测定,然后利用在线BLAST工具进行序列比对,确定扩增序列是否属于BVDV。

1.2.3 病毒分离

吸取200 μL复检阳性的血清样品,悬浮于1 mL无血清DMEM培养基中,经0.22 μm的滤膜过滤除菌后,将滤液接种于长至80%~90%的MDBK细胞,孵育2 h,然后加入含2%胎牛血清的DMEM培养液,于37 ℃、5% CO2条件下培养(用CO2恒温培养箱,下同),每24 h观察一次,5 d后收集细胞培养物,于-80 ℃保存。其间,反复冻融3次,4 ℃、10 000 r·min-1离心10 min,收集上清,进行下一代培养。按此过程盲传3代,细胞出现病变,待约有60%以上的细胞发生病变,即细胞出现大量的脱落、死亡,并且出现明显的空泡变性时,收集细胞培养物,于-80 ℃保存。另设不接毒的细胞作为对照。

1.2.4 电镜观察

将上述反复冻融3次的细胞培养物,于4 ℃、10 000 r·min-1条件下离心30 min,去掉大量细胞沉淀与杂质,收取上清,然后在35 000 r·min-1条件下离心4 h,以浓缩病毒。弃上清,用100 μL PBS悬浮沉淀。吸取10 μL悬液滴于电镜铜网上,室温吸附10 min,用3 μL 2%的磷钨酸钠溶液负染90 s,室温下自然干燥后,于透射电镜下观察病毒粒子。

1.2.5 BVDV分离株的组织半数感染量测定

对MDBK细胞进行传代培养,待培养瓶中细胞状态良好且长至90%以上时,以每孔大约5×103个细胞的规格接入96孔细胞培养板中,每孔0.2 mL,于37 ℃、5% CO2条件下培养12 h,当细胞贴壁生长良好且到80%~90%时接种病毒液。弃掉培养板中的细胞培养液,用含2%胎牛血清的DMEM培养液对BVDV细胞培养物进行10倍倍比稀释(从10-1稀释至10-11),每个稀释度接种8个孔,每孔0.2 mL,同时设定8孔未加病毒的正常MDBK作为阴性对照组,统一于37 ℃、5% CO2条件下培养,每天观察细胞病变情况。当细胞出现空泡、核固缩、溶解和死亡等病变时即将其视为感染,至下一天观察再无新的病变孔出现时,记录每个稀释度出现病变的孔数,按照Karber法计算组织半数感染量(50% tissue culture infection dose,TCID50)[16]。

1.2.6 病毒基因组扩增与序列测定

参照GenBank中的参考序列,设计覆盖基因组全长的引物(表1)。利用RNAprep Pure高效总RNA提取试剂盒提取BVDV细胞培养物的总RNA,利用一步法RT-PCR试剂盒扩增片段,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,送西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行序列测定。测序结果提交NCBI(美国国家生物技术信息中心)进行BLAST比对,然后利用DNAStar 7.0软件分析扩增片段的测序结果,并进行序列拼接。

1.2.7 病毒基因组ORF序列与遗传进化分析

为了明确BVDV分离株ORF在已报道BVDV毒株中的遗传位置,将分离株的ORF序列与从GenBank数据库中下载的35株基因1型(genotype 1)BVDV ORF(GenBank登录号为HQ174294、KF835697、JX419398、KT355592、JX297514、JX297519、KF77278、KU756226、JQ418634、KC963967、KR029825、KF501393、KP941588、EF101530、KJ689448、 AJ133739、DQ088995、KJ541471、KP941586、KF896608、KX857724、KC757383、KT951840、KP313732、KF526381、KR866116、JN400273、KC695801、KC853440、M96751、KU159365、AB078950、JN380088、KP941583和 KX577637),以及15株基因2型(genotype 2) BVDV ORF(GenBank登录号为KC963968、KT875142、JN380086、KX096718、GQ888686、KT832823、KF835701、KF835700、KT875167、HQ258810、KJ000672、HQ174303、HQ174301、KP057803和LC006970)的参考序列,用Meg Align 7.0软件中的Clustal W程序进行多序列对比分析,应用Mega 5.0软件中的邻接法(neighbour-joining, NJ)构建系统进化树,并分析其分类地位。

1.2.8 BVDV开放阅读框同义密码子使用模式分析

为了分析BVDV完整ORF所含有的同义密码子的使用偏嗜性,引入相对密码子使用模式(relative synonymous codon usage value, RSCU)来进行分析计算[17]。RSCU数值大于1.6,说明对应密码子的使用频率显著偏高;RSCU数值小于0.6,说明相应密码子的使用频率显著偏弱。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测结果

提取血清样品总RNA后,利用一步法RT-PCR试剂盒对其BVDV Npro序列进行扩增,获得与预期片段大小相符的PCR扩增条带(大约500 bp)。测序后,对其结果进行BLAST序列对比。结果显示,PCR扩增序列属于BVDV基因组中的Npro编码序列(图1)。

M,DL2000 DNA marker;N,阴性对照;1~16,血清样品。M, DL2000 DNA marker; N, Negative control; 1-16, Serum samples.图1 RT-PCR扩增结果Fig.1 Amplification result of RT-PCR

2.2 病毒分离鉴定

取一份BVDV阳性牦牛血清样品,用无血清DMEM稀释,孵育MDBK细胞2 h后,加入含2%胎牛血清的DMEM,于37 ℃、5% CO2条件下培养,同时设对照组用无血清DMEM孵育,每天光镜观察一次。5 d后,MDBK细胞开始出现细胞病变,细胞变圆,间隙增大,随后细胞浆开始出现空泡变化,并有细胞聚集,部分细胞开始脱落,最后出现“蛛网”现象,表现出BVDV典型的细胞病变,而对照组始终未出现明显变化(图2)。

A,阴性对照的正常MDBK细胞(5 d);B,感染分离株后MDBK细胞发生明显病变(5 d)。A, Cell culture after incubation for 5 days in the negative control; B, MDBK cells exhibited cytopathogenic effects after infection with the isolated strain for 5 days.图2 GSTZ在MDBK细胞上的病变情况(5×)Fig.2 Cytopathogenic effects caused by the isolated strain on MDBK cells(5×)

接种分离株的MDBK细胞培养物,经超速离心纯化制备负染样品,在电镜下可观察到球形病毒粒子,直径大小50~60 nm,与早期报道的BVDV病毒粒子形态大小基本一致,将其命名为GSTZ株(图3)。

在电子显微镜下可以观察到数个直径在50~60 nm的病毒粒子(白箭头所示)。Several 50-60 nm viral particles (white arrows show) were observed under electron microscopy.图3 接种分离株5 d后纯化MDBK细胞培养物在电镜下观察到的病毒粒子Fig.3 Virus particles observed under electron microscope in purified MDBK cell cultures inoculated with isolated strain after 5 days

利用Karber法测定分离株GSTZ的TCID50数值,结果显示,GSTZ株的病毒滴度为5.0×106.5mL-1(以TCID50计)。

2.3 病毒完整ORF序列扩增与序列测定

利用表1所示引物进行RT-PCR扩增,经1%琼脂糖凝胶电泳检测,获得与预期片段大小相符的目的片段(图4)。扩增产物测序后,利用DNA Star 7.0软件中的SeqMan功能对测序结果进行拼接,获得分离株的基因组ORF序列,全长11 691 bp。分离株编码区由Npro、C、Erns、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B序列组成,大小分别为504、306、675、582、1 125、213、1 362、2 052、195、1 044、1 482、2 151 nt。将该序列提交GenBank数据库,登录号为MF173980.1。

M,DL2000 DNA marker;1~13,RT-PCR扩增产物(分别对应于表1中的引物BVDV1—BVDV13)。M, DL2000 DNA marker; 1-13, RT-PCR amplification product (in accordance with the primers BVDV1-BVDV13 in Table 1).图4 GSTZ分离株基因组的RT-PCR扩增结果Fig.4 RT-PCR amplification result of GSTZ strain genome

2.4 GSTZ毒株ORF序列分类

利用Mega 5.0软件中的邻接法对分离株GSTZ的ORF核苷酸序列进行遗传分析,并构建系统进化树(图5)。基因1型和基因2型BVDV在ORF核苷酸序列水平上存在明显的遗传分化,并且同种基因型不同毒株的ORF核苷酸序列也存在遗传分化。本研究分离的GSTZ毒株ORF核苷酸序列明显可划分为基因1型家族成员,与BVDV毒株Bega-like(GenBank登录号:KF896608)和毒株ACM/BR/2016(GenBank登录号:KX857724)的序列一致性较高(分别为93.6%和84.17%)。这一遗传学分化结果很可能是GSTZ毒株长期在牦牛体内以临床上无症状形式持续感染增殖从而逐渐在ORF核苷酸序列中积累了一定的突变位点而形成的。

gt1和gt2别表示基因1型和基因2型。gt1 and gt2 represents genotype 1 and genotype 2, respectively.图5 GSTZ分离株的基因组系统发育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of GSTZ isolates

2.5 GSTZ毒株ORF的同义密码子使用模式

GSTZ毒株来源于牦牛血液,据此认为,探究GSTZ毒株的遗传进化对于提示其如何适应牦牛具有一定的意义。利用同义密码子使用模式评估策略来分析牦牛源BVDV基因组中同义密码子使用模式的遗传特征,以反映病毒在牦牛体内的遗传规律。GSTZ毒株ORF的核苷酸成分总体表现为A+U的含量高于G+C,而且病毒ORF的同义密码子使用偏嗜性也没有很明显地体现出突变压力所特有的遗传特征(即以C或G结尾的同义密码子被ORF“偏爱”使用,而A或U结尾的同义密码子被ORF“嫌弃”)。与之相反,GSTZ毒株ORF对同义密码子AUA(Ile)、UCA(Ser)、CCA(Pro)、AGA(Arg)具有强烈的“偏爱”,反而对CUC(Leu)、UCG(Ser)、CCG(Pro)、ACG(Thr)、GCG(Ala),以及编码Arg氨基酸的4种同义密码子(CGU、CGC、CGA、CGG)非常“嫌弃”(表2)。特别值得关注的是,在GSTZ毒株中,含有CpG二核苷酸的同义密码子在使用方面被病毒自身强力压制着。这一遗传特点反映出,GSTZ在进化过程中除了受到自身基因组突变压力的调控外,还受到来自宿主所施加的选择压力,二者共同塑造了GSTZ毒株ORF的同义密码子使用模式。

为了进一步证实GSTZ毒株ORF在核酸水平上的遗传分类,针对此毒株ORF同义密码子使用模式开展遗传分析(图6)。BVDV基因1型与基因2型毒株ORF在同义密码子使用模式方面同样有着明显的遗传差异。虽然BVDV基因1型毒株ORF同义密码子的使用模式相比基因2型的遗传离散性高,但是GSTZ毒株ORF在同义密码子使用模式上还是可以明显归类于BVDV基因1型的。这在一定程度上也进一步证实了本研究所分离的病毒是属于基因1型的。

3 讨论

与DNA病毒相比,RNA病毒的突变率明显较高[20]。研究表明,BVDV基因组之间存在自然重组,但由于RNA聚合酶没有矫正功能,导致BVDV的变异率较高。在PI动物中,BVDV基因组与细胞RNA的重组被认为是导致BVDV突变并诱导致死性黏膜疾病的一种机制。据报道,BVDV的重组在没有病毒蛋白翻译或病毒RNA依赖RNA聚合酶活性的情况下也会发生。但是,在病毒进化历程中,其他原因也可导致BVDV突变。病毒基因是由核苷酸含量主导的突变动力,以及宿主施加在病毒生命过程中的自然选择压力共同决定走向的[21-23]。依靠自身较高的变异率,BVDV在世界各地广泛分布。

我国西北地区是牦牛主要的栖息地。目前,BVDV已对牦牛畜群的健康繁殖带来了很大影响[24]。杞艳萍[25]研究表明,BVDV在我国西部地区流行较广,经检测,BVDV阳性率较高,且流行的主要为基因1型。赵玉宾[26]在新疆南疆地区的牛场和鹿场检测BVDV抗体,阳性率分别达到90%和30%,且同源性较高,推测牛与马、鹿存在交叉感染的情况。本研究分离牦牛源BVDV毒株,并分析分离株的致病力与遗传进化特点,这可以为深入了解BVDV在我国西北地区牦牛群中的生态学分布提供参考资料。

在分离BVDV病毒的过程中,利用体外敏感细胞MDBK分离病毒、借助透射电镜观察病毒粒子是经常采用的主要技术手段。本研究中,GSTZ毒株感染MDBK细胞后进行病毒分离培养,盲传3代后,细胞出现病变情况,且第5天时引起的细胞病变范围达到60%~70%,经测算,GSTZ毒株的病毒滴度为5.0×106.5mL-1(以TCID50计)。GSTZ毒株所表现出来的致半数细胞培养物感染的能力,从侧面反映出BVDV基因1型在牦牛体内具有的侵染能力。牦牛无论是在体质还是在适应西北特殊环境的能力上,都强于国内其他种类的牛,体外测定的GSTZ毒株病毒滴度在一定程度上体现了牦牛机体与BVDV持续性感染对抗过程的“战况”,即牦牛自身免疫系统虽然无法消灭BVDV的持续性感染,但是免疫系统已尽可能地在降低BVDV对宿主的危害。

在瘟病毒属成员中,相对于BDV与CSFV的遗传多样性,BVDV目前主流的基因型分为基因1型和基因2型[27]。相对于BVDV基因1型毒株在我国不同区域的广泛流行[28-32],BVDV基因2型在遗传多态性方面的研究相对较少[33]。RT-PCR在明晰BVDV病毒遗传信息方面发挥着重要的作用。本研究用RT-PCR方法检测病毒,进而分离病源,并进行基因组序列测定,然后构建系统进化树。结果发现,GSTZ毒株ORF核苷酸序列的遗传学特征属于基因1型。与BVDV基因1型分离毒株的致病性相比,BVDV基因2型分离毒株更容易引发与高死亡率相关的临床症状,如高热、血小板减少、黏膜急性出血等[34]。结合GSTZ分离毒株的来源区域,以及与我国广大地区流行病毒之间的异同点,GSTZ毒株可以作为BVDV灭活用疫苗的候选者之一。此外,深入分析GSTZ遗传学特征与低致病力之间的相关性,也能够为今后研发针对基因1型BVDV的基因工程疫苗提供一些可资参考的数据。

病毒与宿主之间的关系主要体现在共进化(co-evolution)与病毒对宿主的适应性(adaptation)上。本研究对GSTZ分离株ORF同义密码子的使用特征进行分析,结果发现,被病毒强烈压制使用的同义密码子数量要多于被优先选择使用的数量。这种遗传学特征反映出,GSTZ毒株为了持续在宿主体内复制增殖而形成了一套特定的同义密码子使用模式,以此来适应宿主细胞内的环境。有研究指出,病毒基因组同义密码子使用模式的形成是为了更好地适应自然宿主细胞的转录与翻译系统,从而有效利用细胞内的各种生物资源,实现病毒自身的高效表达[35-37]。CpG作为核苷酸二联体出现在病毒或者细菌的基因组中,可以有效刺激宿主免疫系统激活B细胞、自然杀伤细胞、诱导细胞产生I型干扰素,从而对侵染的病原体展开清除行动[38]。值得注意的是,在GC含量占优的大背景中,BVDV GSTZ毒株ORF在选择同义密码子的过程中“刻意”避免使用含有CpG核苷酸二联体的同义密码子。这一遗传学现象的出现在一定程度上反映出,GSTZ毒株通过降低CpG在ORF中的含量从而减弱宿主免疫系统对其的攻击,同时也可以降低BVDV基因组在转录和翻译过程中的碱基堆积,从而降低病毒基因组复制和翻译所需的能量代谢。

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