刘江文 杨双 唐艳红 黄从新

(武汉大学人民医院心内科 武汉大学心血管病研究所 心血管病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060)

完全性房室传导阻滞和病态窦房结综合征等缓慢性心律失常是临床上常见的心律失常疾病，电子起搏器仍然是这类疾病的主要治疗方式。虽然电子起搏器功能越来越强大，体积越来越小，但它仍存在很多缺点，例如术后感染、电池寿命有限、导线容易脱落以及缺乏生理反应性[1]。这些不足之处都限制电子起搏器成为治疗这些疾病的最理想的方法，科学家们开始寻找符合正常人体生理的生物起搏器，生物起搏能克服当前电子起搏器存在的缺点，更加符合人体正常的生理状态。生物起搏指通过干细胞基因调控、基因过表达或抑制等方法来构建出类似“窦房结”的结构，以此来治疗缓慢性心律失常。当前构建生物起搏细胞的方法主要是单基因、多基因联合以及信号通路调控等，选择一项适合的调控方法对于成功构建生物起搏器至关重要。

1 窦房结发育过程涉及的基因

窦房结自干细胞分化开始到具有正常功能的起搏细胞涉及一系列基因表达和沉默。目前普遍接受涉及窦房结调控表达的基因有Shox2、Tbx3、Tbx18、Pitx2、Nkx2.5、Isl-1和HCN通道等，不同的基因在窦房结发育的不同阶段发挥着不同的作用。当前生物起搏中广泛研究的基因有Tbx、HCN和Shox2，而其他生物起搏相关基因(Pitx2、Nkx2.5和Isl-1)的研究仍然匮乏。Tbx家族有一系列同源因子，如Tbx1、Tbx3、Tbx5和Tbx18等，不同的因子在心脏发育过程中发挥不同的作用，目前在生物起搏中研究较多的是Tbx3和Tbx18。Tbx3基因位于染色体12q24.1上，同源基因位于5号染色体，全长为9.0 kb，在进化上具有高度保守性，在胚胎形成时期多个组织及器官均有表达[2]。Tbx18是与心外膜器官发育相关的Tbx1亚家族成员，在心外膜、中胚层和体节前半部分等结构均有表达[3]。Tbx18参与窦房结头部的发育，但并不影响窦房结尾部的功能，而Tbx3不影响窦房结的形态发育，但对窦房结的功能具有重要的影响[4]。胰岛素样生长因子-1是第二心脏区未分化的心脏祖细胞的分子标志，对促进心脏发育和分化起着非常重要的作用[5]。有研究[6]发现Isl-1基因敲除的鼠胚在第9.5天停止心脏发育或出现心脏严重畸形。Shox2对于窦房结的发育和正常结构的形成必不可少，研究[7]表明在Shox2基因缺乏或突变的大鼠胚胎中会导致严重窦房结和窦瓣发育不良及起搏细胞的分化失败。Shox2过表达能促进Isl-1的表达，进而促进与窦房结相关基因如Tbx3和HCN4等的表达，从而促进干细胞向窦房结细胞的分化[8]。此外Hashem等[9]研究表明，Shox2基因敲除会导致胚胎产生缓慢的收缩频率。窦房结细胞区别于心房和心室肌细胞的一个重要特征是4期自动去极化，其中If电流(也称“有趣电流”，起搏特征电流)是导致4期自动去极化的关键，If电流主要由HCN4基因决定。HCN家族有4个成员，分别是HCN1、HCN2、HCN3和HCN4。在哺乳动物心脏中主要存在的是HCN1、HCN2和HCN4，未检测到HCN3的表达[10]。有研究[11]表明HCN4通道贡献了窦房结约70%的If电流，是最主要的组成部分。此外，与HCN1相比，HCN2和HCN4都对环磷酸腺苷具有较强的反应性，但HCN2对环磷酸腺苷的反应更加敏感[12]。

目前生物起搏主要通过起搏细胞的移植来实现。而生物起搏细胞可利用慢病毒或腺病毒载体构建过表达上述如Tbx3、Shox2和HCN4等窦房结调控基因的载体转染干细胞，从而调控干细胞在分化为心肌细胞的过程中分化为起搏细胞[13]。起搏细胞的鉴定则通过观察心肌细胞搏动频率，检测If电流及窦房结发育相关标志基因的表达获得[14]。获得的起搏细胞主要通过左心室游离壁注射以进行体内验证，体外光学标测显示注射位点的自发搏动则证明移植的细胞存活并发挥了作用[15]。而在此之前，起搏细胞的获得及调控方法则显得更为重要。

2 单基因表达构建生物起搏细胞

通过单基因表达来构建生物起搏细胞是长久以来使用最为广泛的方法。目前广泛研究的单基因主要有Shox2、Tbx18和Tbx3。干细胞在分化过程中能产生心房肌细胞、心室肌细胞和窦房结细胞。有研究[16]表明，在胚胎干细胞分化的拟胚体中，用腺病毒构建人Shox2基因表达载体转染能提高干细胞向窦房结细胞的转化效率，检测结果显示Shox2组起搏细胞比例(61.9%)显著高于对照组(26.1%)。同时，起搏细胞标志物如HCN4、缝隙连接蛋白(connexin，Cx)45以及细胞自发收缩频率在Shox2组也明显高于对照组，且Shox2组对异丙肾上腺素和乙酰胆碱具有更好的反应性。同样，Kapoor等[17]通过腺病毒构建过表达Tbx18的载体并转染新生大鼠心室肌细胞(neonatal rat ventricular myocyte，NRVM)，成功诱导出具有起搏功能的细胞，将诱导分化而来的起搏细胞与正常细胞进行比较，可发现在细胞形态、电生理特性、表观遗传学以及对激素的反应等方面均具有高度相似性。研究者将转染Tbx18的NRVM组(Tbx18-NRVMs)与转染绿色荧光蛋白的NRVM组(GFP-NRVMs)比较，发现与心房、心室肌细胞相关标志的mRNA和蛋白表达水平如Cx43、Kir2.1和Actc2在Tbx18实验组中明显下降，同时Tbx18-NRVMs组细胞跳动频率[(95±23)次/min]明显高于GFP-NRVMs组[(46±10)次/min]。而在此之前，Bakker等[18]研究表明Tbx3能让终末分化的心室肌细胞重编程为起搏细胞，这项研究通过转基因构建携带“Cre可诱导的Tbx3表达构建体(CT3)”，然后通过他莫昔芬诱导携带CT3的小鼠产生Tbx3，通过检测Cx40、Cx43、NaV1.5和Kir基因的表达情况，在Tbx3诱导组中检测到起搏细胞的生成。以上实验结果均表明单基因过表达构建生物起搏细胞的可行性。

3 联合基因转染构建生物起搏细胞

过去几十年，绝大部分的研究都集中在与窦房结发育相关的单基因研究，但近年来通过联合基因转染来构建生物起搏细胞的方法逐渐兴起。联合基因转染指同时将两个或多个与窦房结发育相关的基因同时转入干细胞中，使干细胞能分化为起搏细胞。其中涉及窦房结发育的相关基因多种多样，因而也就产生了不同的联合基因转染方式。

3.1 Isl-1和Tbx18联合转染

虽然有研究[19-20]表明将过表达的Isl-1或Tbx18基因单独导入干细胞均能诱导其分化为起搏细胞，但存在起搏细胞转化效率低下，起搏细胞与正常窦房结细胞功能存在差距等问题。为了寻找能提高干细胞转化为窦房结细胞的转化效率的方法，Zhang等[21]将过表达的Isl-1和Tbx18慢病毒与8 μg/mL聚凝胺混合转染脂肪源性干细胞，7 d后收集转染细胞并进行生物起搏功能及标记基因的检测。实验结果发现，无论是与If电流相关的HCN基因表达情况，还是在细胞的自律性方面，Isl-1和Tbx18基因联合组均较任何单一基因转染组高，这表明二者联合转染干细胞比单一基因转染干细胞能得到更高的转化率。

3.2 Tbx3和HCN2联合转染

Tbx3在小鼠的胚胎发育中扮演着重要的作用。Boogerd等[22]发现斑马鱼在转染Tbx3时，能显著抑制传导性较强的Cx40和Cx43的表达，这与Zhao等[23]的研究结果一致。在人诱导多能干细胞过表达Tbx3能使Cx40、Cx43和SCN5A(心房细胞和心室细胞相关基因标志)表达减少，而Cx45和Cx30.2(窦房结细胞相关基因标志)表达增加，但通过全细胞膜片钳技术并未检测到If电流的表达。另一项研究利用腺病毒构建过表达的Tbx3和HCN2基因载体，并在人诱导多能干细胞向心肌细胞分化的过程中加入该病毒载体共培养，5 d后收集细胞进行电生理检测。膜片钳技术可检测到If电流的表达，同时与Tbx3和HCN2基因单独转染相比，Tbx3和HCN2联合转染的细胞表现出了更快的收缩频率，这表明干细胞成功转化为起搏细胞[24]，这也提示Tbx3和HCN2基因联合转染诱导的起搏细胞具有更加完善的生物学功能。

3.3 Shox2、HCN2和Tbx5联合转染

Raghunathan等[25]将慢病毒构建的Shox2、HCN2和Tbx5三个基因表达载体分别转入心脏祖细胞将其诱导分化为起搏细胞，最终在诱导的细胞中未检测到起搏器特异性靶基因(Cx30.2、KCNN4和Tbx3)的表达升高，但利用四环素控制的转录激活共同诱导三者来调节它们在心肌祖细胞中的瞬时表达时，以上指标相对于单基因转染的细胞表达水平明显升高。此外，联合转染诱导的起搏细胞表现出强烈的HCN4电流，而这是起搏细胞的特征电流。转录组学也表现出联合转染的细胞表达丰富的起搏特异性基因及特异性钾和钙通道(KCND2、KCNK2和CACNB1)，结果表明联合基因转染诱导的起搏细胞具有更加完善的生物学功能。

4 信号通路调控构建生物起搏细胞

目前发现与窦房结发育有关的信号通路主要有Wnt信号通路和骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信号通路[26-27]，通过药物干预这两条信号通路能调控干细胞向窦房结样细胞分化。Wnt信号通路包括经典Wnt信号通路和非经典的Wnt信号通路[28]，在窦房结的发育过程中经典Wnt信号通路发挥正向的调控作用。BMP属于转化生长因子β超家族并拥有20个以上的亚族成员。大量研究[29]表明BMP在胚胎早期发育中具有关键作用，例如BMP2基因敲除的大鼠会在心管形成后死亡，BMP5和BMP7同时敲除的大鼠胚胎会在第10.5天死亡[30]。最近的一项研究[31]表明经典的Wnt信号通路(Wnt/β-catenin信号通路)使得心脏中胚层祖细胞向起搏细胞分化而抑制其向心房和心室肌细胞分化。在Flk1+/PdgfR-α+细胞分化的第3周，移除Wnt信号通路的天然抑制剂Dkk1能明显增加Shox2、Tbx18和HCN4的表达以及Tbx3和HCN4阳性细胞的比例。同时加入Wnt信号通路激动剂Wnt3a可进一步增加Shox2、Tbx18和HCN4的表达水平，而Nkx2.5的表达水平明显下降，这与Wnt信号通路能抑制Nkx2.5的祖细胞分化为起搏细胞的研究一致[32]。此外，调控Wnt信号通路能提高人胚胎干细胞分化为起搏细胞的效率[33]，BMP信号通路也被发现有类似的效应。Protze等[34]将BMP信号通路诱导剂BMP4加入人诱导多能干细胞中诱导分化，结果发现BMP4诱导产生的起搏细胞能表达Tbx3，而未检测到心室肌标志物MLC2V和Nkx2.5的表达。之后将获得的起搏细胞转入大鼠心脏中发现能产生异位节律，这表明通过BMP信号通路诱导剂成功诱导出起搏细胞。有趣的是，只有在胚胎分化的第3天加入BMP4才能最大效率地诱导起搏细胞产生，在分化第2天或第4天加入都会导致起搏细胞产生效率变低，这表明BMP信号通路只在特定的时间发挥关键作用。BMP在低浓度能促进人诱导多能干细胞分化为窦房结样细胞，但高浓度时诱导转化效率变低[35]。因而在通过调节信号通路获得起搏细胞时，要特别注意信号通路调节药物使用的时间和剂量，只有这样才能最大效率地获得起搏细胞。

5 总结与展望

目前为止，大部分研究都集中在单基因诱导起搏细胞的相关研究，但近年来多基因联合诱导干细胞分化也逐渐受到人们的重视，目前对这方面的研究还很缺乏。窦房结的发育涉及一系列基因的作用，多个基因同时诱导生成的起搏细胞会更加符合窦房结的正常发育过程。但由于病毒载体只能携带一定长度的基因，联合转染对病毒载体提出了更高的要求。目前通过信号通路来构建生物起搏细胞能克服病毒载体，会损害正常细胞，以及部分基因转染时会导致转染细胞死亡等问题[36]。虽然可通过多种方法调控干细胞分化为起搏细胞，如本文所述的有单基因表达、联合基因转染和信号通路的调控，但目前获得的起搏细胞和正常的窦房结细胞特性之间存在一定的差距。同时干细胞存在多向分化潜能，定向分化为起搏细胞的效率仍然较为低下。未来仍需努力克服这些问题来高效率获取正常生理功能的起搏细胞，为生物起搏细胞的在体研究打下坚实基础，并最终克服电子起搏器的缺陷而进入临床。