刘孟楠，罗钢，陈立，杨思进

1.西南医科大学附属中医医院 心血管内科（泸州646000）；2.西南医科大学附属中医医院 药剂科（泸州646000）；3.澳门科技大学 中医药学院（澳门 999078）

新型冠状病毒肺炎简称新冠肺炎（corona virus dis⁃ease 2019，COVID-19）是一种由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒-2（SARS-CoV-2）引起的传染病，患者主要症状为发热、咳嗽和疲劳等[1-2]，除此之外，还会造成多个器官的损伤[3]及心理应激创伤[4]。基于中医药防治新冠肺炎的可观疗效，各省市相关机构“三因制宜”陆续发布了中医药防治新冠肺炎的方案[5]。新冠0 号扶正辟邪方是由西南医科大学附属中医医院自行研发的用于新冠肺炎防治的中药复方制剂，该药品以免煎颗粒的形式进行发放及销售。该药组方为黄芪、银花、广藿香、连翘、贯众、厚朴、白扁豆、薄荷、荆芥和芦根[6]。现代药理学研究表明该处方的多种药物或有效成分具有抑制病毒及细菌的作用[7]。中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP）是用于中草药药理学研究的网络平台，是目前进行网络药理学分析的主要研究工具，而网络药理学为中医方剂的机理研究提供了一种新的途径[8]。有研究报道新冠肺炎爆发的病源为冠状病毒SARS-CoV-2[9]。本研究利用数据库筛选新冠0号的有效生物活性成分和靶点，分析其治疗新冠肺炎的关键靶点和信号通路；选取SARS-CoV-2 作为核心受体与新冠0 号筛选出的核心成分进行分子对接加以验证，为进一步研究新冠0号及防治新冠肺炎提供指导。

1 材料和方法

1.1 新冠0号所含中药化学成分相关靶点收集及筛选

通过TCMSP检索新冠0号所含中草药的所有有效成分，包括黄芪、银花、广藿香、连翘、贯众、厚朴、白扁豆、薄荷、荆芥和芦根；再以口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18 为标准对化合物的药物动力学进行筛选。运用Uniprot 数据库官方命名，将靶点基因的全称转换为简称，并删除无对应基因名的靶点备用[10]。

1.2 新冠肺炎相关基因靶点收集及筛选

在Genecards数据库中录入关键词“Novel coronavi⁃rus pneumonia”（新型冠状病毒肺炎）收集疾病相关基因。

1.3 筛选新冠0号-新冠肺炎共同作用靶点

利用TCMSP数据库搜索新冠0号关键化学成分的靶点信息，并通过Uniprot 数据库查询与靶点相对应的人类基因名称，然后与上一步筛选出的新冠肺炎的蛋白靶点基因进行映射，得到药物-疾病靶点基因[13]。

1.4 构建中药复方调控网络

为了研究新冠0 号防治新冠肺炎的作用机制，本研究将新冠0 号-新冠肺炎的共同蛋白靶点基因导入Cytoscape 3.8.2软件进行可视化处理，将药物-化合物-疾病靶点以网络图的形式呈现出来。在这个网络图中，键化合物和靶点以节点表示，节点之间相互作用的关系以边来表示，以此筛选核心化合物[11]。以对应靶点数量超过10个的化合物作为核心化合物。

1.5 构建蛋白互作用（PPI）网络及核心基因筛选

以STRING数据平台构建新冠0号防治新冠肺炎靶蛋白PPI网络，分析新冠0号防治新冠肺炎靶蛋白之间的相互作用。将药物-疾病交集靶点导入STRING 数据库，物种设为homo sapiens（人类），最低相互作用阈值设为medium confidence（中等置信程度0.4），其余参数保持默认设置，将所得网络保存为TSV格式备用[11]。

1.6 筛选PPI网络核心基因

在TSV文件中筛选PPI网络中的核心基因，将TSV文件导入Cytoscape 3.8.2软件，使用CytoNCA插件并选择Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、Local Average Conmectivity-based method、Network 作为评分依据，这些数值大小与该节点在网络中的位置的重要性呈正相关，得到打分文件后取所有大于中位值的基因得到核心网络，重复筛选2次，得到核心基因[11]。

1.7 GO功能分析和KEGG通路富集分析

通过Bioconductor 数据库查询药物-疾病共同靶点基因的基因ID。利用R 语言安装Bioconductor 平台相关安装包，设置pvalue=0.05，qvalue=0.05进行GO富集分析和KEGG富集分析，输出结果并绘制气泡图[12-13]。

1.8 分子对接验证

将新冠肺炎的治疗药物α-干扰素、洛匹那韦、利托那韦、利巴韦林、磷酸氯喹和阿比多尔列为阳性对照药物，于PubChem 数据库中下载以上阳性药物及筛选出的核心化合物小分子配体2D 结构，使用ChemOffice软件将其转换为3D结构；经Auto Dock Tools加极性氢、分配电荷、设置可旋转键后保存为pdbqt 格式文件；在PDB 数据库中查找新冠肺炎的的核心基因SARSCoV-2（PDB ID:6LU7）作为蛋白受体；使用Py Mol 将靶蛋白和原始配体分离并去除水分子，将配体和受体导入Auto Dock Tools 软件，分析其三维结构活性部位，采集配体分子在受体活性口袋中的构象模式；最后，使用Auto Dock Vina对接模型。配体与受体结合能越低，二者之间的结合就越稳定，通常以结合能≤-5.0 kcal/mol作为标准以预测的关键活性成分和关键靶之间的结合情况[14]。

2 结果

2.1 新冠0号-活性化合物网络分析

根据化合物的OB和DL的特性，分别筛选出黄芪、银花、广藿香、连翘、贯众、厚朴、白扁豆、薄荷、荆芥和芦根中所含的化合物分别为16、17、9、17、5、2、1、8、1和10种，去重后共71 种化合物，见图1 及表1；通过在Uniprot 数据库分析转换，将Targets 全称转换为Gene Symbol，新冠0号所含的化合物共对应了249个基因。

表1 新冠0号所含有效化合物Table 1 Effective compounds contained in Xinguan No.0

图1 新冠0号所含有效化合物网络图Figure 1 Network diagram of effective compounds contained in Xinguan No.0

2.2 新冠0号-化合物-疾病靶点网络图

在GeneCards 中与新冠肺炎有关的靶点共438 个。将新冠0号对应的相应目标靶点数去重后，共获得249个人源靶标蛋白；通过使用Venny 2.1在线工具寻找新冠0 号所含249 个复合相关靶点与438 个新冠肺炎相关靶点的交集，共获得58个重叠基因（图2）。将新冠0号的活性成分与其对应的疾病-药物重合的靶点导入Cytoscape 3.8.2 形成新冠0 号-化合物-疾病靶点网络分析图（图3）。该网络由115 个节点和297 个边缘组成，其中以节点表示符合相关目标的活性化合物和目标蛋白，以边缘表示活性化合物与目标蛋白之间的相互作用，以矩形的大小表示其连接数量的多少。在本次筛选中香叶木素（Diosmetin）存在于荆芥和薄荷中，β-胡萝卜素（β-carotene）存在于白扁豆和银花中，豆甾醇（Stigmasterol）荆芥、芦根和银花中，山柰酚（kaemp⁃ferol）存在于连翘、贯众、黄芪和银花中，β-谷甾醇（βsitosterol）存在于荆芥、连翘和银花中，槲皮苷（querce⁃tin）存在于荆芥、连翘、黄芪、广藿香和银花中，木樨草素（luteolin）存在于荆芥、连翘、银花和薄荷中；在这些靶点中，以相互连接的数目进行排名，连接超10 个的包括：槲皮苷，共涉及43 个靶点，木樨草素共涉及22个，汉黄芩素（wogonin）共涉及18个，山柰酚共涉及14个，依立酮（irisolidone）共涉及12个，刺槐素（acacetin）和柚皮素（naringenin）各涉及11个，异鼠李素（isorham⁃netin）和花黄素（formononetin）各涉及10个靶点。这表明新冠0 号配方中的化合物可能共同作用于这些靶点，在防治新冠肺炎中发挥药理作用。

图2 新冠0号靶点与新冠肺炎靶点交集韦恩图Figure 2 Venn diagram of intersection of Xinguan No.0 target and COVID-19 target

图3 新冠0号-化合物-疾病靶点网络图Figure 3 Network diagram of Xinguan No.0-compound-disease target

2.3 蛋白相互作用（PPI）网络构建

将58 个药物-疾病重叠的基因提交给STRING 数据库，隐藏游离点，最低相互作用阈值设为中等置信程度。获得了由58 个PPI 网络目标基因，即由58 个节点和748 个边缘组成的网络关系，见图4，边缘代表蛋白之间的相关程度。在STRING 中下载TSV 文件，导入Cytoscape 3.8.2 软件，使用CytoNCA 对TSV 文件进行PPI 网络分析得到核心基因网络，最终筛选出11 个核心基因，包括PTGS2、VEGFA、ICAM1、MAPK8、CASP3、TP53、CCL2、MAPK3、MAPK1、MAPK14和CXCL8（图5），这些可能是防治新冠肺炎的重要靶点。

图4 新冠0号与新冠肺炎作用靶点蛋白相互作用网络图Figure 4 Network diagram of interaction between Xinguan No.0 and target proteins of COVID-19

图5 新冠0号防治新冠肺炎核心蛋白靶点筛选图Figure 5 Screening map of core protein targets for prevention and treatment of COVID-19 in Xinguan No.0

2.4 新冠0 号防治新冠肺炎作用靶点基因本体（GO）富集与KEGG通路富集分析

为了进一步阐明58个候选靶点的可能作用，对新冠0 号防治新冠肺炎的158 个候选靶点进行GO 富集分析和KEGG 生物途径分析。得到生物过程（biologi⁃cal process，BP）条目2015个，细胞组成（cellular compo⁃nent，CC）条目41 和分子功能（molecular function，MF）条目124个，其中各组排名前10的条目见图6。在生物过程中，对脂多糖应答，对细菌来源分子的反应，细胞对生物刺激的反应等排位靠前；在细胞组成中对膜筏、膜微区和膜的调控等排在前面；在分子功能中与细胞因子受体结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性及信号受体激活物的活性等密切相关。KEGG 生物途径分析出与之相关的信号途径功166条，取排名前30 的条目见图7。结果显示，糖尿病并发症的年龄-年龄信号通路、人巨细胞病毒感染和神经退行性变途径-多种疾病通路及多种病毒、炎症相关通路与新冠0 号防治新冠肺炎的机制有关。

图6 新冠0号防治新冠肺炎作用靶点GO富集分析Figure 6 GO enrichment analysis of targets of Xinguan No.0 inprevention and treatment of COVID-19

图7 新冠0号防治新冠肺炎作用靶点KEGG富集分析Figure 7 KEGG enrichment analysis of targets of Xinguan No.0 in prevention and treatment of COVID-19

2.5 新冠0号防治新冠肺炎活性成分分子对接

将SARS-CoV-2 作为核心受体对新冠0 号-化合物-疾病网络中的核心化合物及阳性对照药物进行分子对接。分子对接结果显示新冠0号的关键活性成分与关键靶点对接的亲和力均小于-5.0 kcal/mol，由此表明预测的新冠0号关键活性成分与防治新冠肺炎的关键作用靶点具有较好的结合活性，与网络药理学筛选结果一致，验证了网络药理学具有一定的可靠性，见表2。

表2 新冠0号核心化合物及阳性对照药与SARS-CoV-2的分子对接Table 2 Molecular docking of SARS-CoV-2 and core compound and positive control drug in Xinguan No.0

3 讨论

新冠0 号组方以黄芪、银花为君药，重用黄芪，方以益气固表，御邪于外，银花清热解毒、补气祛邪，二者联用相得益彰[15-17]；广藿香、连翘、贯众及厚朴共为臣药，四药相配取其清热解毒，轻宣透表之功[18]；荆芥解表祛风，薄荷疏风清热而清利头目，厚朴、白扁豆运脾燥湿，下气和中，此四味同为佐药[19]；芦根为使药，其性甘而寒，可清热生津，滋肺清肺，取引经入肺之效[20]。诸药共用，共奏益气解毒、清热化浊之功。现代药理学研究证实黄芪有效成分黄芪甲苷具有包括诱导T细胞活化，调节效应子/调节T 细胞平衡，增强CD45 磷酸酶活性，抑制促炎细胞因子及免疫刺激的作用[16，21]；酸和类黄酮提取物是金银花主要的抗病毒活性成分，其黄酮提取物对H7N9 流感病毒抑制作用最强[17，22]；此外，已逐步验证广藿香、薄荷、荆芥及芦根等的有效成分化合物均有不同程度的抗病毒作用[18-20]。新冠0 号自批准配置以来共生产销售和发放近3 万剂，在2020 年3月疫情较为严重的阶段起到了保健康、稳人心的重要作用，对四川省疫情的防控作出了较大贡献[9]。

通过TCMSP数据库收集新冠0号化合物成分共71个，对应靶点数为249个，其中与新冠肺炎共同的靶点数有58个，如筛选出的核心靶点PTGS2、VEGFA、ICAM1、MAPK8 和CASP3等，此外还有包括白介素在内的多种炎性因子。有研究表明，SARS-CoV-2 病毒感染将启动机体的炎症反应、感染、细胞凋亡等病理过程，免疫力低下的群体感染病毒后会引发体内免疫细胞分泌大量炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12 和IFN-α等，这种因人体免疫系统过度激活导致的细胞因子风暴（cytokine storm）是引起急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）和多脏器功能失常综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的重要原因，亦是新冠病毒致死的主要原因之一。已有文献报道新冠0号的有效化学成分具有提高人体免疫力、抗炎及抗感染的作用，运用中医理论解释其组方的科学性亦表明了该处方具有“御邪于外”“扶正祛邪”的防治效果[23]。

SARS-CoV-2 属于β-冠状病毒，内含大量非结构蛋白。目前已有研究发现血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）能够作为该病毒的宿主细胞受体，抑制病毒与受体的结合具有潜在的治疗意义[24]。研究人员通过计算机辅助药物设计鉴定了一种基于SARS-CoV-2 的有效抑制剂N3，基于结构的虚拟和高通量筛选相结合所筛选的靶向药物对于防治新冠肺炎具有重要意义[9]。根据“新冠0 号-化合物-疾病靶点”网络图选取槲皮苷、木樨草素、汉黄芩素和山柰酚等超过10 个连接基因的化合物作为核心化合物配体与受体SARS-CoV-2 进行分子对接，结果显示这9 种化合物与受体均具有较好的结合能，表明其作为药物进入人体后能与该受体进行结合的可能性大因此存在潜在的作用价值。槲皮苷、木樨草素、依立酮、刺槐素和花黄素与SARS-CoV-2 的结合能均≤7 kcal/mol，表明其发生作用的可能性更大，表明新冠0号具有抑制SARS-CoV-2 病毒的潜在能力，起到治疗COVID-19 的作用，这些观点在柴胡达原饮、玉屏风散等中医药防治新冠肺炎的研究中亦得到了类似的结论[25-27]。虽然阳性对照药物如洛匹那韦、利托那韦、利巴韦林和阿比多尔都显示出了较好的结合活性，其确切的作用机制和疗效拥有一定的循证医学证据支撑，但根据文献报道使用大剂量的抗病毒治疗产生的药物副作用可能会对人体产生不可逆的损伤[28-30]。中医药具有多成分、多靶点、双向调节、副作用少等优势特点，其在防治新冠肺炎中还具有更大的潜力亟待挖掘[31]。

4 结论

本研究采用网络药理学结合分子对接的方法从“药物-疾病-靶点”角度探讨新冠0号防治新冠肺炎的分子机制。分析结果表明新冠0 号可通过槲皮苷、木樨草素、汉黄芩素、山柰酚和依立酮等成分作用于新冠病毒靶点SARS-CoV-2 及机体PTGS2、VEGFA、ICAM1、MAPK8 和CASP3 等因子，影响多条病毒及炎症相关通路活性以起到防治新冠肺炎的作用。本研究初步确定了新冠0 号通过靶向SARS-CoV-2 防治新冠肺炎的的科学性，基本明确了该处方的有效成分组成，为临床合理应用及防治新冠病毒感染提供了有价值的理论依据。

（利益冲突：无）