余金慧，马文文，陈 欣，汤永涛，周传江＊

（河南师范大学水产学院，河南新乡 453007）

目前，由于十年禁渔，鱼类资源在部分水域锐减，对于濒危且资源量稀少的鱼类进行资源调查存在诸多困难，同时基于DNA和eDNA在鱼类分类鉴定方面的迅猛发展[1]，对濒危物种的资源检测日益重要，从馆藏标本中获取基因信息成为有效补充途径，但对于福尔马林标本中提取目的基因片段的相关报道较少[2-6]，因此提取馆藏福尔马林保存濒危鱼类的DNA，并获得保护鱼类有效的eDNA引物，对于有效获取水体中鱼类时空分布和资源量信息具有积极推动作用。福尔马林保存样品中获得的DNA在生物进化、系统发育、保护濒危物种以及研究种群遗传学中也具有重要意义[7-8]。

福尔马林是一种保存标本常用防腐剂，但在长期保存条件下，随着保存时间的延长，提取的DNA质量会逐渐下降。近期研究表明，福尔马林并未破环DNA的分子结构，DNA仍完整地存在于组织中，仅仅造成基因与基因、蛋白质与蛋白质、基因与蛋白质之间发生交联作用[5]，需要用缓冲液长时间的进行浸泡和置换[9]。提取DNA的结果也受到多方面因素的影响，实验过程中样本的大小和采样部位都会影响提取DNA的质量[8]和获得量，保存标本过程中的温度也会影响DNA保存的效果。原位杂交实验也显示DNA并没有由于福尔马林的长期浸泡而被消解，只是造成DNA发生交联作用难以获得[9]。由于实验方法、标本保存环境和条件的不同，解交联的效果不同，难以保证基因与蛋白质之间的交联被完全解开，所获得的基因会发生片段化，因此本研究先从短片段提取和扩增开始进行实验探索。

现有福尔马林保存标本提取及富集DNA的实验中，实验材料保存时间多在1年以下，因此根据之前的实验方法对提取及富集DNA的步骤做了以下几方面的优化[10-14]：通过增加缓冲液置换的时间，并在此期间进行适当的加热；增加蛋白酶K、DTT、SDS等的用量；减少DNA的冻融次数和时间；扩增过程中适当提高退火温度等方法，经过多方组合优化后均可显著提高实验的成功率（DNA含量和扩增片段的长度）。具体优化后实验方法报道如下。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料及试剂

实验材料：两尾九十年代福尔马林保存的北方铜鱼标本（分别用1、2表示）；采用长江流域酒精保存的铜鱼；一对基于铜鱼（Coreius heterodon，登录号：NC020042、JF906110）、圆口铜鱼（Coreius guichenoti，登录号：NC020041、JF906108）利用BioEdit软件自行设计的线粒体DNA细胞色素b引物Cytb-1。

表1 铜鱼属DNA Cytb-1扩增引物及反应条件

实验试剂：1×GTE溶液（100mmoL/L氨基乙酸、10mmoL/L Tris-HCL、1mmoL/L EDTA）；DTT（二硫苏糖醇）；SDS（十二烷基磺酸钠）；蛋白酶K；NH4Ac（醋酸铵）；ddH2O。

1.2 实验方法

经过对比现有已报道方法并结合提取效果，总结为以下优化后的实验方法。以越南鱊、兴凯鱊作为外类群，使用Phylosuite软件[15]基于贝叶斯信息标准（BIC），每1000代取样一次，运行结束后，丢弃25%的样本，对剩余的抽样树进行整合，构建50%的一致树，使用后验概率值（PP）作为节点支持率，构建北方铜鱼的系统发育树，以证实本实验方法的可行性、准确性。

1.2.1 DNA的提取

用剪刀、镊子选取固定形态、保存状况良好的福尔马林标本，取2g的肌肉组织、背鳍鳍条、鳃盖边缘；将组织放入1.5mL的离心管中，加入1mL1×GTE缓冲液，水浴锅60℃孵育7d，每12h换一次缓冲溶液，消化过程中进行适当的震荡；吸取GTE溶液，室温干燥；加入500μLGTE溶液95℃，水浴加热15min，室温冷却5min，吸去GTE溶液；加入100μL蛋白酶K、50μL SDS、50μL DTT，60℃水浴加热24h；若溶液仍为浑浊状态，应再添加蛋白酶K、DTT，在此过程中可添加较多的DTT，以提高提取效率；冷却至室温；加入500μL苯酚，均匀混合，离心机10000r/min，离心10min，保留上清液。重复3次；加入相当于上清液2.5倍体积的无水乙醇，0.5倍体积的NH4Ac，放入-20℃保存24h；离心机6000r/min，离心10min，保留沉淀；室温干燥5h；加入40μL ddH2O溶解即得到DNA提取液。

1.2.2 DNA的扩增

10μl体系扩增，选择北方铜鱼的目的基因（PCR扩增的模板）、引物Cytb-1、引物Cytb-2、Mix酶、ddH2O，PCR扩增如下：预变性选择94℃，5min；变性94℃，40s；复性选择53℃，40s；延伸选择72℃，80s；共35个循环；72℃，10min；最后12℃停止。

第一次PCR扩增产物的产量不足，不能达到测序要求，为此，本文使用二次PCR进一步富集。二次PCR的方法为第一次PCR扩增产物作为二次PCR扩增的模板，其他步骤与第一次PCR相同。

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳

PCR扩增结束后立即进行凝胶电泳制备1%琼脂糖凝胶，点样、电泳。凝胶成像如图1所示：

图1 Cytb-1引物二次PCR产物电泳图

1.2.4 系统发育分析

本研究选择北方铜鱼（Coreius septentrionalis）、铜鱼（Coreius heterodon）棒花鱼（Abbottina rivularis）各1条Cytb基因序列，圆口铜鱼（Coreius guichenoti）和麦穗鱼（Pseudorasbora parva）各2条Cytb基因序列，根据最佳分区模型和最适核苷酸替代模型，构建贝叶斯树（MrBayes）。结果如图2所示。

图2 基于Cytb基因的贝叶斯法（MrBayes）系统发育树。节点上的数字是MrBayes的支持率，物种名称后面的数字是GenBank登录号。图中显示了外类群，北方铜鱼（Coreius septentrionalis）加粗放大。

2 结果及分析

结果显示提取铜鱼（酒精保存）的DNA浓度平均值为245.7ng/μL，提取北方铜鱼（福尔马林保存）的DNA浓度平均值为485.5ng/μL，A260/280=1.57～1.80。可以看出此实验方法可以提取DNA片段，其中可能存在蛋白质、碳水化合物等因素的影响。

图1是Cytb-1引物二次PCR的电泳图，设计的目的条带为204bp，电泳条带与目的条带长度在同一范围内，且通过测序成功得到目的条带的基因序列。但由于在扩增过程中为了避免模板浓度低、电泳过程中目的条带不明显，实验中引物量略多，在电泳图中可以看到引物二聚体。可根据实验适当减少引物用量，以进行二次PCR。图2表示依据Cytb基因序列构建系统发育树，结果显示北方铜鱼与铜鱼、圆口铜鱼亲缘关系最近，且铜鱼属成为单系群，越南鱊和兴凯鱊位于系统发育树基部位置。可以证实实验方法的可行性和准确性。

3 结论与展望

使用此方法已成功提取出北方铜鱼的Cytb基因片段，所获得的基因最大片段在400bp左右，但实验周期较长。根据实验研究发现，提取的质量和测序的成功率随保存时间增加而降低[16-17]。根据夏颖哲等实验方法，可以得到长片段的DNA，但是实验过程中并未获得长片段的基因，因此推测可能是以下原因：

（1）基因与基因、蛋白质与蛋白质、基因与蛋白质之间确实存在交联作用[5]，导致DNA难以提取。我们在实验中未能成功获得大片段基因，可能是由于不同标本保存时间、状态以及保存过程中环境条件的不同[8]，实验试剂、设备的不同等原因导致提取DNA的效果不尽相同。可根据自身实验条件、实验对象保存情况对实验方法进行优化，提取甲醛标本基因片段的实验仍需要进行改进和优化，以进一步提高解交联的效果。

（2）也可能基因与基因、蛋白质与蛋白质、基因与蛋白质之间并不存在解交联的过程，馆藏样品组织中的基因组确实受到福尔马林长期作用的影响发生片段化，而提取过程的处理使其基因发生片段化加剧。

导致福尔马林保藏标本提取基因片段困难的原因未能获得一致认可，基因与基因、蛋白质与蛋白质、基因与蛋白质之间存在的交联作用使提取基因片段效果不佳的结论，还需要进一步进行科学研究和探索。