李 萌，王旭东，罗昭标，宋嘉宝，曲 鹏，候宁宁，郭林青，饶 智，马 林

（1. 郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450002；2. 江西省烟草公司抚州市公司，江西 抚州 344000；3. 四川中烟工业有限责任公司 新型烟草制品中心，四川 成都 610021；4. 四川三联新材料有限公司新型烟草事业部，四川 成都 610100；5.红云红河烟草（集团）有限责任公司，云南 昆明 650231）

烟草发酵是卷烟加工过程中重要的环节，微生物在发酵过程中发挥重要作用。发酵后烟叶刺激性减小，烟草特征香气显露，吸食品质改善。烟叶发酵的方法一般分为人工发酵和自然发酵[1]，自然发酵时间长、成本高，人工添加有益微生物在烟叶发酵中能够缩短发酵和醇化时间、降低烟碱含量和增加香气含量，改善烟叶品质[2]。早在20世纪中期，IZQUIERDO[3]利用微球菌属（Micrococcus）和芽孢杆菌属（Bacillus）菌株或者两者混菌发酵烟叶，烟叶抽吸品质得到改善。ENGLISH 等[4]利用从烟叶上分离出的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和嗜热芽孢杆菌（Thermophilic bacillus）发酵烟叶，经混菌发酵的烟叶产生悦人的芳香。利用微生物诱导烟叶产生香气物质的研究在国内开展较晚，罗家基等[5]将从烟叶中筛选出的优势芽孢杆菌随机混合发酵，经评吸发现其发酵烟叶比未施加菌液的发酵烟叶具有更加明显的烟香；赵铭钦等[6]利用2 种增香菌和3 种微生物酶配制而成的烟草发酵增质剂对在线配方烟叶进行了处理，经评吸表明微生物发酵增质剂对提高卷烟整体香吃味质量作用明显；郑泽浩[7]利用多个高产水解酶的菌株配伍制备复合菌剂，喷洒于烟叶表面发酵，能显著改善烟叶品质；王颖等[8]研究单一菌株和复配菌株对卷烟叶组化学成分的影响，烟叶吸食品质明显改善；帅瑶等[9]使用解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliticus）对烟叶进行混菌发酵，能缩短发酵时间，提高蛋白酶活力和烟叶感官质量；龙章德等[10]采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和嗜麦芽寡养单胞菌（Oligotrophic maltophilia）混合发酵，发现混合微生物发酵后烟叶香气质、香气量均有所增加，烟叶刺激性和杂气均降低。目前，关于混合微生物发酵烟叶的研究中菌株多为细菌且未对发酵条件进行优化，应用酵母发酵烟叶研究较少。酵母是一类重要的产香微生物，可利用多种基质产生香气物质，具有安全性好、生长速度快等诸多优点。低次烟叶香气量不足、杂气重、刺激性强，难以在配方中应用或仅能用于低档卷烟，通常只能通过加香处理补充其香气。郭林青等[11]将从水果中筛选的产香酵母（有孢汉逊酵母属，Hansenia）接种到烟叶上进行发酵，发现对烟末发酵能产生香味物质。鉴于此，将前期筛选到的2 株产香酵母混合接种于低次烟叶中进行发酵，探究混菌发酵对烟叶致香成分的影响，以弥补低次烟叶香味不足的缺点，旨在为应用多菌株混合发酵改善低次烟叶品质提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品与菌株 低次烟叶来源于河南中烟工业有限责任公司技术中心（2016 年度平顶山DBF31 复烤烟叶）。产香酵母菌株为郑州轻工业大学烟草生物技术实验室分离筛选的优质酵母菌株：YJX（有孢汉逊酵母属）和MG（毕赤酵母属，Pichia）。

1.1.2 供试培养基 YPD 培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸膏1%。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 主要试剂：葡萄糖（AR，天津市致远化学试剂有限公司）、蛋白胨（AR，北京奥博星生物技术有限责任公司）、无水硫酸钠（天津市致远化学试剂有限公司）、二氯甲烷（天津市富宇精细化工有限公司）、氯化钠（AR，天津市恒兴化学试剂制造有限公司）。

主要仪器设备：烟草固态发酵反应舱（郑州轻工业大学烟草生物技术实验室自主研制）、落地恒温振荡器HZQ-211C（上海一恒科学仪器有限公司）、电热恒温水浴锅HWS-12（上海一恒科学仪器有限公司）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器LXC35L（合肥华泰医疗设备有限公司）、无菌操作台SW-CJ-2D（苏州净化设备有限公司）、低温冷却液循环泵DLSB-5/20（郑州长城科工贸有限公司）、SHSL型调温电热套（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 产香酵母生长曲线的测定 将产香酵母接种到种子培养基中，于30 ℃、180 r/min 条件下活化培养24 h，在无菌条件下，将活化后的种子液接种至新的种子培养基中，并设置空白对照。每隔一段时间取样，采用紫外可见分光光度计检测其OD600，以反映菌体生长量。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 最佳发酵温度的确定 取1 000 g 低次烟叶放入固态发酵反应舱，在发酵湿度70%、混菌比（YJX∶MG，下同）1∶1、接种量20%的条件下，分别在24、27、30、33、36 ℃下发酵24 h，发酵结束后测定烟叶挥发性致香成分含量。

1.2.2.2 最佳混菌比的确定 取1 000 g 低次烟叶放入固态发酵反应舱，在发酵湿度70%、发酵温度30 ℃、接种量20%的条件下，分别以混菌比1∶0、1∶2、1∶1、2∶1、0∶1 条件下发酵24 h，发酵结束后测定烟叶挥发性致香成分含量。

1.2.2.3 最佳接种量的确定 取1 000 g 低次烟叶放入固态发酵反应舱，在发酵湿度70%、发酵温度30 ℃、混菌比1∶1 的条件下，分别取10%、15%、20%、25%、30%的菌悬液喷洒在低次烟叶上发酵24 h，发酵结束后测定烟叶挥发性致香成分含量。

1.2.3 正交试验设计 在单因素试验的基础上，选取发酵温度（T）、混菌比（H）、接种量（J）3个因素，每个因素选3个水平，以烟叶致香成分含量为指标，进行正交试验，确定最佳发酵条件。正交试验因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平Tab.1 Orthogonal test factors and levels

1.2.4 烟叶挥发性致香成分分析 采用同时蒸馏萃取技术结合气相色谱/质谱（GC/MS）联用测定发酵烟叶挥发性致香成分。将发酵后的烟叶在40 ℃烘箱中干燥，用粉碎机粉碎后过孔径为0.425 mm筛，准确称取25 g 烟末样品、30 g 氯化钠和200 mL水放入同时蒸馏萃取装置一端的圆底烧瓶中，装置的另一端盛有60 mL 二氯甲烷，在60 ℃下水浴加热，同时蒸馏萃取2.5 h。同时蒸馏萃取完成后，二氯甲烷萃取液用无水硫酸钠干燥，4 ℃下静置过夜，过滤，加入1 mL的内标物后浓缩，萃取液浓缩不足1 mL 时，浓缩结束，用二氯甲烷定容至1 mL，过0.22 µm 滤膜于2.0 mL 的色谱瓶中，立即进行上机检测。

1.2.5 GC/MS 检测条件 色谱柱HP-5MS（60 m ×0.25 mm×0.25µm）；进样口温度280 ℃；载气为高纯氦气；柱温箱为程序升温，起始温度50 ℃保持1 min，以4 ℃/min 升至148 ℃保持1 min，以2 ℃/min升至172 ℃保持1 min，以4 ℃/min 升至280 ℃保持5 min；分流比5∶1；流速3.0 mL/min。离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；EI 离子源70 eV；质量扫描范围35～550 amu；采用NIST14检索。

1.2.6 感官评吸 将最佳发酵条件下发酵24 h 的烟叶切丝后进行卷制，置于温度（22±1）℃、相对湿度（60±2）%的恒温恒湿箱中平衡48 h。由7 人组成的专业评吸小组根据YC/T 138—1998[12]中的方法进行评吸，对抽吸结果进行感官质量评价。

1.3 统计分析

采用Excel 2010、Origin 2018 和SPSS 22.0 对试验数据进行处理和统计。

2 结果与分析

2.1 酵母菌YJX和MG生长曲线

YJX 和MG 的 生 长 对 数 期 为8～18 h、6～20 h（图1）。因此，取13 h 作为YJX 和MG 的最佳活化时间。

图1 酵母菌YJX和MG生长曲线Fig.1 YJX yeast and MG yeast growth curve

2.2 单因素试验结果

2.2.1 发酵温度对烟叶致香成分总量的影响 由图2 可知，在24～36 ℃，烟叶致香成分含量随温度的升高先增加后减少。当发酵温度在30 ℃时，烟叶中的致香成分总含量最高；之后温度升高，烟叶中的致香成分总量减少。综合考虑，选用27、30、33 ℃进行正交优化试验。

图2 发酵温度对烟叶致香成分总量的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on the total amount of aroma components in tobacco leaves

2.2.2 混菌比对烟叶致香成分总量的影响 单菌株发酵的烟叶致香成分总量普遍低于混菌发酵的烟叶致香成分总量。由图3 可知，在混菌比为1∶1时，烟叶致香成分含量最高；在混菌比为1∶2 和2∶1条件下，烟叶致香成分总量均有所下降。综合考虑，选择混菌比1∶2、1∶1和2∶1进行正交优化试验。

图3 混菌比对烟叶致香成分总量的影响Fig.3 Effect of mixed bacteria ratio on the tobal amount of aroma components in tobacco leaves

2.2.3 接种量对烟叶致香成分总量的影响 由图4可知，随着微生物接种量的增加，烟叶致香成分总量呈现出先增大后减少的趋势。当接种量为25%时，烟叶致香成分总量最高；当接种量为20%和30%时，烟叶致香成分总量下降。综合考虑，选择15%、20%和25%进行正交优化试验。

图4 接种量对烟叶致香成分总量的影响Fig.4 Effect of inoculation volume on the tobal amount aroma components in tobacco leaves

2.3 正交试验结果

由表2 可知，影响发酵烟叶致香成分总量的各因素主次顺序为混菌比>接种量>发酵温度，说明混菌比的作用最大。最佳发酵条件为H3J3T2，即混菌比为2∶1、接种量为25%、发酵温度30 ℃时，增香效果最好。

表2 正交试验结果Tab.2 Orthogonal experimental results

2.4 单菌和混菌发酵烟叶挥发性致香成分分析

通过同时蒸馏萃取和GC/MS 分别对未发酵烟叶、单菌和混菌发酵烟叶样品挥发性致香成分进行测定。采用NIST14谱库检索定性和内标法定量，结果如表3 所示，共检测到挥发性致香成分95 种，包含12种醇类、21种羰基类、8种酸类、15种酯类和内酯类、23种烃类、10种杂环类和6种酚类化合物。

表3 不同处理发酵烟叶挥发性致香成分GC/MS分析结果Tab.3 GC/MS analysis results of volatile aroma components in tobacco leaf fermentation under different treatments μg/g

续表3 不同处理发酵烟叶挥发性致香成分GC/MS分析结果Tab.3（Continued） GC/MS analysis results of volatile aroma components in tobacco leaf fermentation under different treatments μg/g

续表3 不同处理发酵烟叶挥发性致香成分GC/MS分析结果Tab.3（Continued） GC/MS analysis results of volatile aroma components in tobacco leaf fermentation under different treatments μg/g

不同处理下发酵烟叶的挥发性致香成分含量有明显差异,在醇类化合物中，苯甲醇、苯乙醇和芳樟醇等重要香味物质含量都有提高，其中苯甲醇和苯乙醇是芳香族氨基酸裂解产物，可增加烟叶的花香香味[13]，芳樟醇是类胡萝卜素降解产物，也属于萜类化合物，能够为烟草增加柔和的玫瑰香味。羰基类化合物中大多是类胡萝卜素降解产物，由于其化学物质阈值相对较低，对烟叶香气质量起主要作用[14]。与未添加微生物发酵的样品相比，混菌发酵烟叶样品中大马酮和β-紫罗兰酮含量分别提升61.14%和100.25%，且检测出4-羟基-β-二氢大马酮、螺岩兰草酮、法尼基丙酮、α-大马酮等重要香味物质，增加了烟草中的清香、玫瑰香等[15]。在酸类化合物中，棕榈酸香气物质含量较未添加微生物发酵提升79.86%，能够增加丰满度，间接影响烟气的香味。在酯类和内脂类化合物中，二氢猕猴桃内脂是重要的类胡萝卜素降解产物，混菌发酵烟叶中二氢猕猴桃内酯含量较未添加微生物发酵提高147.67%，对消除烟气刺激性具有重要作用，亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯较未添加微生物发酵分别提升42.76%和57.10%，这2 种物质对于增加烟气的醇和和浓度具有明显的效果。

总体来说，混菌发酵烟叶中的挥发性致香成分含量明显高于单菌发酵和未添加微生物发酵烟叶，混菌发酵的挥发性致香成分含量较YJX 发酵提高22.9%，较MG 发酵提高16.4%；混菌发酵烟叶中的醇类、羰基类和酸类相对含量明显增加，酯类和内酯类相对含量无明显变化（图5）。

图5 挥发性致香成分不同类别含量分布Fig.5 Content distribution of different categories of volatile aroma components

2.5 烟叶发酵感官评吸结果

不同处理方式烟叶感官评吸结果（图6）显示，混菌发酵和单菌发酵烟叶均好于未添加微生物发酵烟叶，混菌发酵烟叶感官评吸结果最好。YJX∶MG=2∶1 发酵后的卷烟香气质、香气量、浓度、余味改善较为明显。

图6 不同处理方式卷烟评吸结果Fig.6 The evaluatuin results of cigarettes by different treatment methods

3 结论与讨论

本研究以低次烟叶作为发酵底物探究混菌发酵对烟叶品质的影响，主要考察了发酵温度、混菌比和接种量对烟叶香味成分的影响。通过正交优化试验得到最佳发酵条件为发酵温度30 ℃、混菌比2∶1、接种量25%、发酵时间24 h，发酵过程中致香物质含量影响因素的主次为混菌比>接种量>发酵温度。随着发酵温度的升高，发酵烟叶致香成分总量先增加后减少，可能是由于温度过高微生物代谢受到抑制导致[16]。混菌比是影响烟叶致香物质含量最主要的因素，随着混菌比的变化，烟叶中致香成分总量差异明显，这可能是由混合菌株的协调性决定的，在发酵体系中不同菌株的接种比例直接与这个体系中每一种微生物的生长密度和速度有关，影响混合发酵产物的组成，只有混合比例合适才能更大地发挥各自的优点[17]。

烟叶的香气是评定烟叶品质的重要指标[18]。与优质烟叶相比，低次烟叶最大的缺陷是香气量不足。烟叶香气物质按致香官能团进行分类可分为醇类、酮类、醛类、酯类、酸类、杂环类和烃类等[19]，其中醇类、酮类、醛类和酯类对烟叶香气起主导作用，其含量可用来衡量香气的强弱[20]。本研究利用混菌发酵烟叶致香成分含量明显高于单菌发酵，挥发性致香成分含量显著提升。就具体致香成分而言，苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇、叶绿醇、大马酮、β-紫罗兰酮、棕榈酸、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯等重要香气物质含量增加，这可能是由于酵母菌代谢主要促进类胡萝卜素降解、芳香族氨基酸代谢；金合欢醇、α-大马酮、2，4-二甲基苯甲醛等重要香气物质只有在混菌发酵烟叶中检测到，这可能是由于混菌发酵能够获得某些单一微生物发酵无法得到的产物[21]。感官评吸结果表明，混菌发酵丰富了烟叶的花香和果香味等，这与增加的香味物质多为花香和果香物质一致，发酵后烟叶香气充足，刺激性减小，感官质量明显提高。

本研究通过正交试验优化混菌发酵烟叶条件，利用GC/MS 对不同处理发酵烟叶中的挥发性致香成分进行分析，发现混菌发酵能够明显增加低次烟叶醇类和羰基类等重要香气物质含量，发酵后低次烟叶感官品质显著提升。本研究采用混菌发酵改善低次烟叶品质，但其发酵机制还有待进一步探索，发酵条件也有待进一步深入优化，为应用到工业发酵中提供参考。