顾丽琴，濮阳隆翔，谢 芳

肿瘤的发生、发展、浸润、转移及复发不仅与患者遗传易感性相关，还与机体的免疫状态和肿瘤微环境密切相关。肿瘤细胞表面低表达或不表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)分子使T细胞缺乏活化必需的第一信号，以致难以介导有效的抗肿瘤免疫应答[1]。以自然杀伤细胞(NK细胞)为代表的固有免疫应答主要针对MHC分子下调或缺失的恶变细胞及病毒感染细胞[2]；因此，NK细胞及其固有免疫应答在抗肿瘤免疫中的作用不可或缺[3-4]。

2012年，Topalian等[5]和Brahmer等[6]共同报道了抗PD-L1、PD-1单抗治疗肿瘤的临床研究成果，使针对免疫卡控点的免疫治疗成为肿瘤治疗的新热点。但仅部分肿瘤晚期患者在抗PD-L1或PD-1抗体治疗后肿瘤出现部分或完全消退[7]，这提示针对PD-1/PD-L1分子及信号的肿瘤免疫治疗可能还存在其他机制。作为肿瘤免疫治疗的“明星分子”PD-1/PD-L1分子在NK细胞及其抗肿瘤免疫中的作用尚不明确。因此，该文现就PD-1/PD-L1分子和NK细胞的生物学特征、PD-1/PD-L1分子在NK细胞中的表达以及对NK细胞抗肿瘤免疫的影响作一综述，探讨PD-1/PD-L1分子在调控NK细胞抗肿瘤免疫应答中的重要作用，为肿瘤免疫治疗提供新思路。

1 PD-1/PD-L1分子的生物学特性

1.1 PD-1/PD-L1分子的发现PD-L1分子又称B7H1、CD274，属于B7家族成员，其全长为290个氨基酸，包含1个IgV样区、1个IgC样区、1个跨膜疏水区和1个由30个氨基酸组成的胞内区[8]。PD-L1分子广泛表达于抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)、T细胞、NK细胞以及内皮细胞、胰岛细胞等免疫细胞和非免疫细胞[8]，黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、肾细胞癌等肿瘤细胞胞膜和胞质中也可见表达[9-10]。其受体PD-1分子为相对分子质量为(5.0～5.5)×104的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily, IgSF)成员[11]。其分子结构包括胞外IgV段、跨膜段和胞内段；胞内段则包含一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)和免疫受体酪氨酸转化基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM)。PD-1分子主要表达于活化T细胞，为活化T细胞的标志之一[11]。随着研究的深入，T、B、NK细胞以及肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)中均发现PD-1分子的表达[11]。

1.2 PD-1/PD-L1分子的作用PD-1/PD-L1分子是免疫系统中抑制免疫反应、调控免疫耐受及维持免疫平衡的一对重要负性共刺激分子，与CTLA-4、B7-H3、B7-H4等并称为免疫卡控点分子，能从多个环节和信号通路向T细胞传递抑制性信号[11-12]。

当活化T细胞表面的PD-1分子与APC表面PD-L1分子结合后，可通过抑制PI3K/Akt通路进而抑制抗凋亡基因BCL-XL的表达来促进效应性T细胞凋亡，上调p27kip1抑制效应性T细胞的增殖[13]。PD-1/PD-L1信号还可通过抑制蛋白激酶Cδ的磷酸化导致T细胞活化增殖所必需的IL-2分泌下降，使效应性T细胞增殖受抑并滞留在G1期[11,13]。研究还发现PD-1/PD-L1信号可通过募集Src同源区蛋白酪氨酸(src homology 2-containing protein-tyrosine phosphatase 1/2, SHP1/2)的磷酸化[11]，抑制酪氨酸激酶ZAP70的磷酸化，并下调T细胞活化必需的第一信号，介导T细胞的死亡[11]。SHP1/2的磷酸化还可抑制转录因子BCL-6的表达，阻止CD4+T细胞分化为滤泡性辅助性T细胞[11]。

正常生理条件下，PD-1/PD-L1信号通路的激活可启动多条抑制信号及通路发挥抑制T细胞活化、生存、增殖、迁移并诱导效应性T细胞凋亡[11,13]，以维持免疫平衡，避免自身免疫性疾病的发生。免疫性脑脊髓膜炎、免疫性糖尿病的动物模型也证实PD-1/PD-L1信号通路的缺失会导致自身免疫性疾病的发生[14]。在感染性免疫以及移植免疫中，PD-1/PD-L1信号通路的激活可有效调节免疫反应的强度，抑制T细胞的活化和增殖，避免T细胞对组织的持续性损伤[15]。

1.3 PD-1/PD-L1分子与肿瘤继黑色素瘤、非小细胞肺癌之后，胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、肾透明细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、食管癌、子宫颈癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤等众多肿瘤细胞中均发现存在PD-L1分子的过表达，且其与肿瘤患者的不良预后密切相关[5, 16-17]。深入研究发现肿瘤细胞表面的PD-L1分子与活化T细胞中的PD-1分子相互作用，进而抑制T细胞的活化、增殖、迁移并诱导效应性T细胞的凋亡[5]。同时，研究还发现PD-1配基化所致的SHP1/2磷酸化不仅下调TCR信号，还可抑制STAT1并活化Foxp3，诱导CD4+T细胞向调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)转化[11]。Foxp3为Tregs重要的转录因子，PD-L1分子及信号对肿瘤患者Tregs的维持、诱导和扩增起着极为重要的作用[18]。由此可见，PD-1/PD-L1分子及信号是协助肿瘤细胞逃逸免疫监视，继续生长、浸润及转移的重要因素。

近来的研究还发现肿瘤组织中过表达的PD-L1分子还通过逆向信号调控Ki-67从而介导肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及肿瘤干细胞的维持[19]；Wang等[20]认为PD-L1分子及信号还参与了乳腺癌抗凋亡及耐药机制。

2 NK细胞的生物学特性

2.1 NK细胞的简介NK细胞起源于骨髓，因其胞质内含有较大颗粒，又被称为大颗粒淋巴细胞，约占外周血淋巴细胞的15%。除了骨髓和外周血外，NK细胞还分布于淋巴结、脾脏、肺、肝脏及胎盘等免疫和非免疫组织[2]。NK细胞与T细胞和B细胞不同，其特征性表达CD16、CD56以及CD96分子，同时具有“身份识别”和杀伤能力。其表面还存在识别MHC分子并抑制其具有杀伤能力的抑制性受体，即能识别自身细胞而避免“误杀”[3-4]。当细胞受病毒感染或细胞突变导致MHC分子下调或不表达，NK细胞表面抑制性受体的抑制能力减弱，活化性受体激活并通过分泌穿孔素和颗粒酶清除病毒感染细胞或突变的细胞；由此，NK细胞所介导的固有免疫应答在感染免疫和肿瘤免疫中发挥重要作用[3-4]。

2.2 NK细胞的类型与功能以NK细胞为代表的固有免疫应答的启动是由其表面抑制性受体和活化性受体及其信号的相互协调与平衡所决定。现已发现NK 细胞表面受体有数十种，其主要来源于IgSF和C型凝集素超家族(C type lectin domain family, CLSF)[4]。这两种超家族又各自包含抑制性受体和活化性受体，其中，IgSF中有可与MHCⅠ类分子相互作用的自然杀伤细胞抑制性受体(killer cell inhibitory receptor, KIR)；也有促进NK细胞活化启动固有免疫应答的自然细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptors, NCR)，如NKp46、NKp44和NKp30[3]。CLSF成员中CD94分子以二硫键与2型跨膜分子NKG家族中不同成员形成异源二聚体，既有起抑制作用的CD94-NKG2A，又有起活化作用的CD94-NKG2C；人白细胞抗原E(human leukocyte antigen E, HLA-E)则是这两组受体的共同配体[21]。

KIR、CD94-NKG2A等抑制性受体胞内段均含有ITIM，而非抑制性受体则缺乏ITIM，但含有与信号转导分子相互作用的赖氨酸。如CD94-NKG2A中CD94的凝集素样结构域可识别HLA-E-MHC先导肽，通过和先导肽上的氨基酸残基以及MHC分子α1和α2结构域发生作用，同时通过糖类的相互结合增强与HLA-E-MHC先导肽的相互作用，促使ITIM发生磷酸化并募集SHP-1/2，下调NK细胞的活性。一旦病毒感染或细胞恶变导致表面MHC I类分子表达下调或缺失时，NK细胞表面与之相结合的KIRs、CD94-NKG2A等抑制性受体的抑制作用减弱，同时DNAM-1、CD94-NKG2C和NCRs等活化性受体则与T细胞受体复合物ζ链相关分子DAP12结合，通过其含有的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)募集ZAP-70等酪氨酸激酶并促使其磷酸化，促进活化性受体激活，启动对病毒和恶变细胞的清除[22]。

进一步研究发现，NK细胞不但存在复杂的受体及其信号调节网络，还存在着不同亚型。Cooper等[23]根据特征性标志CD56分子表达程度的不同，将NK细胞分为CD56bright、CD56dim两大亚群。其中CD56brightNK细胞杀伤力较弱，被认为是未成熟的NK细胞，CD56dim则标志着NK细胞分化成熟并具有较强的杀伤能力。进一步研究发现NK细胞表面另一特征性标志CD16分子可特异性结合复合或单体IgG并介导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity, ADCC)。因此，NK细胞又被分为两类功能不同的CD56dimCD16+NK细胞和CD56brightCD16-NK细胞免疫调节亚群[3]。

随着研究的深入，NK细胞表面不同抑制性受体和活化性受体与NK细胞的功能存在更为复杂的相互关系。仅依靠CD56分子和CD16分子划分NK细胞的亚型不能阐述NK细胞在天然免疫应答中的作用机制。Chiesa等[24]研究发现CD56dimNK细胞在初次和再次感染巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)的过程中表现出不同的免疫应答，类似适应性免疫反应。当再次感染CMV时，NK细胞可快速扩增、高表达活化性受体NKG2C等，并分泌表达高水平的穿孔素、颗粒酶及IFN-γ和TNF-α等细胞因子，即产生记忆性[25]。动物实验结果亦证实小鼠再次感染CMV后体内其LY49+NK细胞亦表现为具有较强的记忆功能[26]。接下来的研究还发现一群分泌IL-10具有抑制NK细胞活性的NK细胞亚群[27]。Poznanski等[28]则根据CD56、CD16分子以及表面其他受体的表达程度并结合其不同的功能将NK细胞分为细胞毒性、调节性和记忆性NK细胞三类。其中CD56dimCD16+细胞毒性NK细胞高表达NCR、KIR等分子。CD56brightCD16-调节性NK细胞低表达NCR，但高表达KIR、NKG2A分子。记忆性NK细胞则高表达CD57、NKG2C等分子，低表达NKp30、NKp46分子，不表达NKG2A分子。这些NK细胞新亚群在免疫应答中的机制尚未完全明确，使得NK细胞在固有免疫以及适应性免疫中的作用机制更加复杂。

3 PD-1/PD-L1分子与NK细胞

3.1 PD-1/PD-L1分子对NK细胞的影响近年研究发现PD-1、CTLA-4、Tim3、TIGIT等免疫卡控点分子在NK细胞中也有表达[3,24]。Hsu等[29]和Kim等[30]的研究发现PD-1分子仅在成熟CD56dimNKG2A-KIR+CD57+NK细胞中表达，在CD56brightNK细胞中几乎不表达。与PD-1-NK细胞相比，PD-1+NK细胞的增殖能力、细胞毒性、细胞因子分泌功能均降低，Rambaldi等[31]则认为PD-1/NKG2A途径则还可诱导Tregs的扩增，进而影响适应性免疫应答。

3.2 PD-1/PD-L1分子与NK细胞的肿瘤免疫临床研究发现，在肺癌、肾细胞癌、多种血液系统肿瘤以及消化系统肿瘤中NK细胞表面异常表达PD-1分子，且其含量往往与肿瘤患者的预后密切相关，即PD-1分子表达越高，其预后越差。PD-1阻断剂可明显恢复NK细胞的抗肿瘤功能[32-33]。Liu等[32]对多种消化道肿瘤进行研究发现，部分CD56+NK细胞表达PD-1分子，阻断PD-1信号后，CD56+PD-1+NK细胞较CD56+PD-1-NK细胞中CD107a、NKG2D的表达水平明显升高，NKG2A的表达则下降。Liu等的研究结果亦证实CD56dimCD16+NK细胞中PD-1分子表达水平明显高于CD56brightCD16-NK细胞。Huang等[34]认为NK细胞表面PD-1分子与靶细胞表面PD-L1分子的配基化通过损伤整合素“由外向内”信号，抑制NK细胞分泌颗粒酶等细胞毒作用，降低NK细胞杀伤肿瘤的能力。Abeyweera等[35]认为PD-1分子胞内段ITIM是抑制NK细胞活化的主要机制。

前列腺癌、肺癌等研究进一步发现高表达的PD-L1分子通过抑制NK细胞表面NKG2D配体显著影响NK细胞的杀伤能力[36-37]。动物实验也发现，将NK细胞与PD-L1+肿瘤细胞共培养时，NK细胞的增殖和杀伤功能被明显抑制。Hsu等[29]认为阻断NK细胞表面PD-1、TIGIT等免疫卡控点分子是肿瘤免疫治疗的关键。当免疫卡控点分子及其信号受到阻断，NK细胞的抗肿瘤活性和增殖能力可得到恢复[29]，并有效启动NK细胞的杀伤能力，引发ADCC，释放TNF-α、IFN-γ等细胞因子；免疫卡控点分子及其信号的阻断还可促进以CD8+T细胞为主抗肿瘤的适应性免疫应答，逆转T细胞的耗竭[38]。

Dong等[39]在白血病的研究中发现，相对PD-L1-NK细胞，PD-L1+NK细胞可有效杀伤髓系白血病细胞K562。体内动物实验也证实PD-L1+NK细胞具有更强的杀伤肿瘤细胞能力。

PD-1/PD-L1分子在不同NK细胞亚群中的表达情况以及在实体肿瘤和造血系统来源肿瘤中调节免疫反应是否存在不同的分子机制还有待深入分析。

4 结语

随着研究的深入和科技的发展，肿瘤免疫治疗已取得了显著进展，尤其是针对免疫卡控点PD-1/PD-L1分子的治疗延长了肺癌、黑色素瘤等晚期患者生存时间。部分患者在免疫治疗中存在的低反应性又促使针对PD-1/PD-L1等分子在免疫应答中的作用机制被深入探究。肿瘤的发生发展、浸润转移及复发是多基因参与、多步骤发展的复杂过程，是机体内在因素、病毒感染等外界因素联合作用逐渐形成，是机体免疫系统与肿瘤之间清除、平衡和逃逸的博弈。研究免疫卡控点分子PD-1/PD-L1在NK细胞活化、杀伤肿瘤细胞效应中的作用，探讨其对NK细胞为代表的固有免疫应答和适应性免疫应答之间的调控与相关信号通路，以期确定这些重要免疫卡控点的表达规律，从而制定更为精准和合理的联合免疫治疗方案，为恶性肿瘤精准免疫治疗提供新的靶点以及理论基础。