张杏羡

（天津华兴医院检验科，天津 300270）

生物分子的定量检测是实现疾病诊断与健康监测的重要方式，传统的免疫学检测方法包括酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、化学发光法（chemi luminescence，CL）等，其检测灵敏度多限制在10-14～10-12mol/L，无法满足疾病的早期诊断需求[1]。对此，临床提出采用单分子免疫检测技术（single molecule detection，SMD），用以提高免疫检测灵敏度。单分子免疫检测是一种“数字化”免疫检测技术，可将免疫复合物限制在极小范围内（nl 以下），对产生的信号进行绝对计数，其灵敏度高达10-18mol/L，可充分满足多种生物标志物的检测需求[2]。目前，单分子免疫检测模式可分为原位检测与随机分配检测，前者所需仪器昂贵，对操作者要求较高，当前难以实现临床应用[3]。随机分配检测则包括微阵列芯片与微液滴两种形式，其中，基于微阵列技术的单分子免疫检测已实现一定的自动化与商业化，是当前单分子检测最常用技术，而Quantarix 公司的Simoa 是目前最具代表性的单分子免疫检测技术[4]。本文以Simoa 为代表，对单分子免疫检测的技术原理及临床应用进行综述，以期为超高灵敏度检测方法的进一步开放提供理论基础。

1 技术原理

以Simoa 为例，基于微阵列芯片的单分子免疫检测是在毫米级芯片上雕刻（或浇筑）成千上万个微米级微井，每个微井体积约40 fl 左右，随后将免疫复合物磁珠分配于微井中，再借助高分辨率荧光显微镜对荧光点进行计数，依据泊松分布理论，计算同时含珠子与荧光产物孔的数量/含珠子孔总数的比值，以此确定测试样品中的蛋白质浓度[5]。相较于传统检测方式，以Simoa 为代表的单分子免疫检测技术可通过数字方式确定标志物浓度，其灵敏度高，可同时完成多达10 种目标分子的检测，且重复性好、线性范围高、灵活度强，可依据试验目的进行方案开发与优化[6]。近年来，磁珠的全自动化检测发展逐渐成熟，仅需增加磁珠分配和信号读取模块，便可实现单分子免疫检测的全自动。目前，Quanterix Simoa HD-1 数字式单分子免疫阵列分析仪这一全自动方案已进入市场应用，前景广阔。

2 临床应用

目前，单分子免疫技术主要应用于生物标志物的检测，包括蛋白质、核酸与生物小分子等，可准确监测生物标志物变化，有助于疾病的早期诊断与预后评估。研究证实[7，8]，单分子免疫技术具有超高灵敏度，其灵敏度与核酸检测较为相似，且检出限低，大大避免了灵敏度不足引起的假阴性，在神经退行性疾病、肿瘤、传染病等领域均具有理想检测价值。

2.1 在神经退行性疾病领域中的应用 神经退行性疾病是神经元结构与功能退化引起的功能障碍性疾病，包括阿尔兹海默症（alzheimer disease，AD）、多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）及脊髓小脑性共济失调（spinocerebellar ataxias）等，早期诊断尤为重要。现阶段，神经丝蛋白（neurofilament protein，NFP）、β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）、tau（T-tau）蛋白和磷酸化tau（P-tau）蛋白等均为神经退行性疾病的常用生物标志物[9]。当神经元膜结构受损，相关标志物可释放入组织液中，最终游离于脑脊液与血液中，随着病情进展，其标志物水平可发生不同程度变化[10]。因此，通过脑脊液与血液的标志物检测，可获取相关疾病的动态信息。研究发现[11]，受到血-脑屏障的影响，血液中的标志物浓度远低于脑脊液，且无法用现有手段准确检测。因此，临床多以脑脊液作为此类疾病的检测标本，但脑脊液采集需穿刺取样，创伤较大，不利于临床推广，相较而言，血液检测不仅取样方便、损伤较小，且易于保存，整体成本较低[12]。基于此，积极寻求血液替代脑脊液的检测方式，是改善标志物检测体验的重要方向，而单分子免疫检测技术的出现恰好满足了以上需求。借助单分子免疫检测技术的超高灵敏特性，可充分检测出血液样本中的生物标志物水平[13]，在神经性退行性疾病的诊断中具有重要意义。

2.1.1 阿尔兹海默症 阿尔兹海默症是典型的神经退行性疾病，其生理表现主要为Aβ 蛋白沉积与神经纤维缠结（neurofibrillary tangles）的形成，其中神经纤维缠结是由Tau 蛋白组成，因此，检测其Aβ 蛋白与Tau 蛋白浓度，是获取其病情信息的重要方式[14]。Mielke MM 等[15]采用单分子检测技术对464 名认知正常者的血浆总Tau 含量进行了检测，结果显示，认知正常者血浆总Tau 水平每升高1 个log 单位，其认知障碍风险可增加2.5 倍。Hwang SS 等[16]对耗散型石英晶体微量天平（QCM-D）技术与Simoa 技术在Aβ 蛋白检测中的应用价值进行了对比，发现Simoa 的灵敏度为QCM-D 技术的500 倍，其检测限分别为0.22 nmol/L 与125 nmol/L。由此可见，单分子免疫技术对阿尔兹海默症标志物具有积极检测价值，有助于该病发生风险及病情进展的评估。

2.1.2 多发性硬化症 多发性硬化症属于炎症性神经退行性疾病，据Ferraro D 等[17]研究证实，神经丝轻链（neurofilament light，NfL）与多发性硬化症患者疾病严重程度及残疾进展相关联，该生物标志物有作为多发性硬化症疾病活动度的潜力。因此，临床多以NfL 作为多发性硬化症疾病的敏感生物标志物，用于监测组织损伤和MS 的治疗效果[18]。Disanto G等[19]采用单分子阵列对健康对照组（n=254）与两个独立多发性硬化症组（n=142、246）的血清NfL 水平进行了检测，结果表明，单分子阵列技术的检测灵敏度是酶联免疫吸附试验与电化学发光检测的126、25 倍，该法可准确量化健康对照组中预期的低NfL浓度，有助于异常值与正常值的准确区分。综合可见，单分子免疫检测对多发性硬化症标志物具有较高灵敏度，诊断价值显著。

2.1.3 脊髓小脑性共济失调 脊髓小脑性共济失调是遗传性共济失调的主要类型。Wilke C 等[20]研究指出，NfL 可作为神经元损伤的标志物，在退行性共济失调中发挥外周生物标志物作用，用于预测脊髓小脑性共济失调的小脑萎缩与临床进展。Ljungqvist JC等[21]采用新型超灵敏单分子阵列技术对患者血清NfL 浓度进行了测定，检出效果显著。综上可知，单分子免疫检测技术可有效测定脊髓小脑性共济失调的血清生物标志物，有助于疾病的检出与鉴别。

2.2 在传染病领域中的应用 目前，传染病检测多集中于病原体自身标志物与细胞因子等方面。在病原体标志物的检测中，高分子免疫检测技术对病原蛋白的检测灵敏度较高，可作为核酸检测的有效补充手段，对感染的诊断与病情监测具有重要意义[22]。在细胞因子检测方面，已有研究证实[23]，高分子免疫检测技术可检出血液中82%的细胞因子，而ELISA 法只能检出25%。此外，高分子免疫检测可在传染病潜伏期和免疫反应前，检测其生物标志物，实现更早期的实时诊断，为传染病筛查、治疗与疾病监测提供有利帮助，对传染病传播概率的下降具有重要价值。

2.2.1 获得性免疫缺陷综合征 获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）简称艾滋病，由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起，其免疫相关性病毒蛋白含量是反映疾病情况的重要标志物，其中HIV p24 抗原是最丰富的HIV 蛋白，但常规方式尚无法早期检测其HIV 特异性抗体[24]。基于此，有学者开发了超灵敏p24 定量分析的高分子免疫检测技术，用以测定HIV 变化，其检出限与定量限分别为2.5 fg/ml、7.6 fg/ml，较传统免疫测定法高出400 倍[25]。在一项针对成人患者抗逆转录病毒治疗研究中[26]，利用高分子免疫检测技术对HIV 生长情况进行了测定，研究发现，潜伏感染过程中HIV指数级复制仅发生于CD32-CD4+T 细胞中，只能通过此类高分子免疫检测技术检测到。由此可见，高分子免疫检测技术对潜伏期HIV 具有良好检出作用，有利于AIDS 病情的阻断与控制。

2.2.2 结核病 结核病（tuberculosis）是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，主要侵害人体肺部，以活动性肺结核的传染性最为严重。因此，对可能发展为活动性结核病的潜伏感染患者需及时检出并采取措施，但常规超敏反应皮试试验、γ 干扰素释放试验分析技术（IGRA）均无法有效区分潜伏性感染与活动性结核[27]。对此，Ben Salah E 等[28]利用高分子免疫检测技术，对IGRA 无法区分的标本进行了高灵敏检测，结果显示，基于高分子免疫检测技术开展的γ 干扰素检测，其灵敏度是IGRA 技术的100 倍，可进一步鉴别不确定结果中的真阳性与阴性样本。以上研究说明，利用高分析免疫检测技术，有助于结核病的鉴别与诊断。

2.2.3 新型冠状病毒肺炎 新型冠状病毒肺炎是指2019 新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病，其病原物为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。目前为止，临床尚无针对SARSCoV-2 特效药。因此，早期诊断与防控是阻止其传播的最有效手段[29]。2020 年12 月28 日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用全自动高通量免疫分析仪器Simoa HD-X Analyzer检测IgG 抗体，其检测目标为人体针对新冠病毒刺突蛋白区域产生的抗体，通过疑似感染者IgG 抗体的检测开展COVID-19 诊断。据临床研究显示[30]，Simoa 对抗体检测的敏感性高达100%，特异性为99.2%，由此可见，高分子免疫检测技术可用于测定疫苗免疫诱导的抗体反应。此外，有研究证实[31]，通过高分子免疫检测技术检测免疫调节细胞因子与趋化因子等超敏感蛋白质生物标记物，有望实现COVID-19 的早期高灵敏度诊断，对轻、重症区分及疾病感染进程的监测均具有重要意义。

2.3 在肿瘤领域中的应用 肿瘤属于复杂性疾病，根据癌变器官的不同可分为多种亚型，具有较高的致死风险，其早期诊断尤为重要。据Wilson DH 等[32]研究发现，使用单分子阵列检测技术可有效测量根治性前列腺切除术后患者的血清前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）水平，且术后测量最低点PSA，对患者预后情况具有积极预测价值，可减少不必要的辅助放射，有利于复发等情况的及早发现与治疗。Shi Y 等[33]基于高分子阵列技术开发了超灵敏定量血液LIF 检测试剂盒，用于测定胰腺导管腺癌患者的血液LIF 水平，以监测其疾病变化。另有研究应用高分子阵列技术开发了细胞外囊泡免疫测定方法，用于通用细胞外囊泡与肿瘤衍生细胞外囊泡的测定，在肿瘤诊断中更具有积极评估作用。总之，高分子免疫检测技术对肿瘤标志物诊断具有较高检测价值，有助于患者预后与治疗反应的评估，对复发筛查患者的靶向二级治疗提供了良好基础。除此之外，受到检测灵敏度的限制，当前临床使用的肿瘤标志物依然为血液水平较高的普适性标志物，在肿瘤疾病的检测中，其敏感度及特异性均存在一定限制。在此背景下，高分子免疫检测在发现新型高特异性标志物方面具有较大潜力。Limor C 等[34]研究显示，应用单分子阵列技术可对microRNA 进行数字直接检测，对提高检测效率及大规模筛选新型靶标具有意义。

3 总结与展望

单分子免疫检测技术具有超高灵敏度，可充分反映疾病的病理信息与发展进程，在神经退行性疾病、肿瘤、传染病等疾病的体外诊断中具有广阔的应用前景，大大推动了相关疾病的早期诊断、治疗与药物开发。近年来，以Simoa 技术为代表的单分子免疫检测技术已逐步向高灵敏、高通量、自动化等方向发展，其临床应用也日趋成熟，有望成为重大疾病早期诊断与预后评估的有力工具。但目前为止，单分子检测技术被正式商业化的产品极少，且均为国外研制，国内则主要停留在实验室科研层面，其应用发展尚面临着许多挑战，有待技术层面与商业化层面的多重优化。