张润涛，李佳，高乔，节笑笑，刘聪，倪艳，康永✉，张爱荣，赵惠淳

（1. 山西省中医药研究院，山西 太原 030012；2. 山西广誉远国药有限公司，山西 晋中 030800）

定坤丹由红参、鹿茸、西红花等药物组成，具有滋补气血、调经舒郁的功效，主要用于气血两虚、气滞血瘀所致的月经不调、经行腹痛、崩漏下血、赤白带下、血晕血脱、产后诸虚和骨蒸潮热等，被广泛应用于妇科疾病，如卵巢功能不全、月经病、不孕症和更年期综合征等［1］。目前定坤丹产品主要有口服液、水蜜丸与大蜜丸3 种剂型，其中定坤丹口服液具有口感好、吸收快且起效迅速的优点，而定坤丹水蜜丸则具有作用缓慢、药效持久且容易保存的优点。本实验通过复制雌性去势大鼠模型，使大鼠处于卵巢功能缺失状态，从而引起大鼠雌激素分泌紊乱，以此来探究定坤丹口服液及定坤丹水蜜丸对卵巢功能的调节作用，同时对二者的药效进行对比。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康雌性SD 大鼠，SFP 级，200 只，体质量180～200 g，由北京斯贝福生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2019-0010。大鼠饲养于清洁恒温环境，平均温度25 ℃，平均湿度37%，15～20 次/h 全新风，12 h光照、12 h黑暗。

1.2 主要药物、试剂与仪器

定坤丹口服液（山西广誉远国药有限公司，批号：4112011002）；定坤丹水蜜丸（山西广誉远国药有限公司，批号：3282011096）；补佳乐戊酸雌二醇片（Bayer，批号：583A）。

大鼠孕酮（P）ELISA试剂盒（批号：202104）、大鼠雌二醇（E2）ELISA试剂盒（批号：202104）、大鼠促卵泡刺激素（FSH）ELISA试剂盒（批号：202104）、大鼠黄体生成素（LH）ELISA 试剂盒（批号：202104）、大鼠前列腺素E2（PGE2）ELISA 试剂盒（批号：202104）、大鼠前列腺素F2α（PGF2α）ELISA 试剂盒（批号：202104）均购自江苏酶免实业有限公司；C5微孔板检测仪（美国伯腾）。

2 方法

2.1 分组与去势大鼠模型的建立

全部大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、定坤丹水蜜丸组（水蜜丸组）以及定坤丹口服液高剂量组（高剂量组）、定坤丹口服液中剂量组（中剂量组）、定坤丹口服液低剂量组（低剂量组）。雌性大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，仰卧位固定于大鼠板上，剃毛消毒后，沿腹部正中线距阴道口2.5 cm 处切开，使用剪刀在正中定位处打开约1.5～2 cm 的皮肤切口。除空白组外，其余大鼠分离两侧输卵管进行结扎，结扎后完整摘除两侧卵巢，分两层缝合切口，用无菌生理盐水冲洗伤口，碘伏消毒；空白组大鼠仅切开，不结扎。术后连续3 d 各组大鼠腹腔内注射青霉素4 万IU/d 以预防感染，6 d 后拆线，结扎术后大鼠可正常存活即为去势大鼠模型复制成功。

2.2 分组给药

术后1 周开始灌胃给药，按人与大鼠体表面积换算系数确定给药剂量。高、中、低剂量组分别灌胃定坤丹口服液10、5、2.5 mL/kg，阳性对照组予补佳乐0.12 mg/kg，水蜜丸组给予定坤丹水蜜丸1.75 g/kg，空白组和模型组大鼠灌服等剂量蒸馏水，每天灌胃1次，连续灌胃4周。每周称量大鼠体质量，调整给药剂量。

2.3 标本采集

末次给药结束后，禁食不禁水12 h，10%水合氯醛溶液麻醉后进行大鼠腹主动脉取血，一部分放入抗凝管中测定凝血功能，另一部分放入EP管中室温静置2 h后3 000 r/min离心20 min，取上清，制备血清，-20 ℃保存。摘取大鼠子宫，并称取子宫的质量，计算子宫指数。子宫组织用生理盐水冲洗后，立刻置于10%甲醛中固定。

子宫指数=子宫质量（g）/体质量（g）×100%

2.4 ELISA 法检测大鼠血清中FSH、LH、E2、P、PGE2、PGF2α含量

严格根据ELISA 试剂盒说明书步骤进行操作，检测大鼠血清中FSH、LH、E2、P、PGE2和PGF2α的含量。

2.5 HE染色观察大鼠子宫组织病理变化

生理盐水冲洗后，立刻将子宫置于10%的甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，200 倍光镜下观察子宫内膜损伤等病理形态学的变化情况。

2.6 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件进行统计学分析。计量资料用±s表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两组间的多重比较采用LSD 分析，若方差不齐则采用Dunnett's T3多重比较法进行检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般状态及子宫指数比较

造模期间，空白组大鼠皮毛光滑，摄食、饮水规律，体质量持续稳定增长；模型组大鼠毛发暗淡无光泽，情绪易激惹，体质量较空白组明显增加（P＜0.01）。给药后，与模型组相比，中剂量组大鼠体质量继续增加（P＜0.01），水蜜丸组大鼠体质量有增加趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；定坤丹口服液各剂量组与水蜜丸组大鼠相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组大鼠子宫指数较空白组明显降低（P＜0.01）；定坤丹口服液各剂量组、水蜜丸组及阳性对照组大鼠子宫指数较模型组显著升高（P＜0.01）；中、低剂量组与水蜜丸组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠子宫指数及体质量比较（xˉ±s，n=10）

3.2 各组大鼠凝血功能指标比较

模型组大鼠PT、TT较空白组显著升高（P＜0.01）；高剂量组大鼠PT值较模型组降低（P＜0.05），高、中剂量组及水蜜丸组的TT值较模型组显著降低（P＜0.01，P＜0.05）；定坤丹口服液各剂量组与水蜜丸组大鼠PT及TT值相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠凝血功能指标比较（xˉ±s，n=10）

3.3 各组大鼠性激素指标比较

与空白组相比，模型组大鼠血清P、E2、PGE2 水平显著降低，FSH、LH、PGF2α 水平显著增高（P＜0.01）；与模型组相比，定坤丹口服液各剂量组、水蜜丸组大鼠血清P、E2、PGF2α 水平均不同程度升高，LH、FSH、PGE2 水平均不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），其中中剂量组大鼠的FSH 水平以及高、中剂量组大鼠的PGE2 水平较水蜜丸组改变更明显（P＜0.05），其余指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠性激素指标比较（xˉ±s，n=10）

3.4 各组大鼠子宫病理形态的比较

与空白组比较，模型组大鼠子宫明显萎缩，内膜上皮及子宫腺上皮细胞呈小圆柱状，质核比下降，子宫内膜层变薄，间质细胞呈纺锤形，细胞变小，肌层萎缩变薄；与模型组相比，各给药组大鼠子宫均有不同程度的萎缩，水蜜丸组及定坤丹口服液高剂量组子宫萎缩情况减轻，间质细胞排列密集，两者相比无显著差异。见图1。

图1 去势模型大鼠子宫病理（HE，×200）

4 讨论

定坤丹始于清乾隆年间，为宫廷秘方，乾隆帝因其可“安定坤富”而将其命名为“定坤丹”。该方由红参、鹿茸、西红花等中药组成，由四君子汤、四物汤、逍遥散、八珍益母丸、理中丸、柴胡疏肝散等经典名方化裁而成，具有共行补益气血、滋补肝肾、调经舒郁、健脾行气、温中祛寒、活血止痛之功效，用于治疗气血两虚、气滞血瘀所致的月经不调、行经腹痛、崩漏下血、赤白带下、血晕血脱、产后诸虚和骨蒸潮热等。

现代药理研究发现，定坤丹在原发性卵巢功能不全（POI）的治疗中具有良好的效果［2-3］。POI 的发病原因包括遗传学、免疫学、医源性、环境和生活方式等因素［4］。LH、FSH、E2、P作为女性卵巢功能不全的早期标志物，在疾病的发生过程中可表现为LH、FSH 含量升高，E2、P含量降低，其中FSH 最为敏感［5］。女性的卵泡发育、性激素水平的调节以及正常生殖功能的维持主要依靠下丘脑-垂体-卵巢轴，E2、FSH 和LH 是女性生殖轴的重要激素［6］，其中E2受LH 和FSH 的调节，共同维护女性生殖系统正常的生理功能［7］。有研究表明，前列腺素与子宫收缩有密切关系，其中研究较多的是PGF2α 和PGE2，PGF2α 可促进子宫收缩，而PGE2则对子宫收缩产生抑制作用［8-9］。

本实验通过摘除大鼠卵巢复制雌性去势大鼠模型，使大鼠处于卵巢功能缺失的状态，并在此基础上进行定坤丹口服液与定坤丹水蜜丸的药效对比。实验结果表明，定坤丹口服液和水蜜丸均能不同程度升高大鼠血清P、E2、PGE2 水平，降低LH、FSH、PGF2α 水平，证明定坤丹能够通过调节大鼠雌激素紊乱的状态从而促进卵巢功能的恢复，另外给药后TT降低也说明出定坤丹能够促进凝血功能的改善。

水蜜丸是指药材细粉以水和蜂蜜按适当比例混匀为黏合剂制成的药丸，其作用缓慢，药效持久，优点在于使用的蜂蜜量较少，含水量低，可便于长期保存和服用。口服液剂是以中药汤剂为基础，提取中药内的有效成分，并按照注射剂的加工工艺合成的口服液体制剂，具有服用剂量小、味道好、吸收快、奏效迅速和质量稳定等优点。通过本实验对定坤丹口服液和水蜜丸进行药效学对比，结果显示二者具有相似的治疗效果，因此可以在不同的应用场景根据使用人群的偏好进行选择。