侯会会，郭倩倩，曹楠婧，孙奋琪，李峰，郭素堂*

（1.山西医科大学 生物化学与分子生物学教研室，山西 太原 030001；2.山西省肿瘤医院分子生物研究室，山西 太原 030013）

0 引言

结直肠癌在我国是一种常见疾病，近年来呈逐渐上升趋势。结直肠癌的发生是一个多因素多阶段的过程，涉及一系列遗传和表观遗传学的改变，死亡率很高。越来越多的研究发现，癌基因及抑癌基因的失调与结直肠癌的发生、发展及耐药性密切相关［1-2］。因此，结直肠癌治疗迫切需要新的靶标及更有效的分子标记。

乙酰化是组蛋白最常见的翻译后修饰，组蛋白乙酰化水平受组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶酶活性的动态平衡调节［3］。许多研究表明组蛋白乙酰化失衡与癌症发生之间存在密切联系。组蛋白H3K27乙酰化（H3K27ac）是发生在组蛋白H3，第27位赖氨酸的乙酰化修饰，一般在调控细胞增殖和分化的基因中富集［4］。目前，H3K27ac是基因表达转录激活的一个标志［5-6］。有研究表明，在结直肠癌细胞中，H3K27ac激活lncRNA EIF3J-AS1的表达，促 进 细 胞 增 殖［5］，在 肺 癌 中 H3K27ac激 活LINC00519表达，且与患者的预后不良相关［7］。在前列腺癌中，H3K27ac与肿瘤分型相关［8］。在乳腺癌中，H3K27ac上调ZNF649基因的表达诱导曲妥珠单抗耐药［9］。

TRIM家族蛋白有共同的氨基末端三分结构域：环-B盒-1/2螺旋线圈（RBCC）。其中环-B盒介导蛋白之间的相互作用，环结构具有E3泛素连接酶的特性［10］。依据羧基末端结构域不同，TRIM蛋白可分成13个亚型，TRIM11属于C-IV亚家族，位于人11号染色体上［11］。TRIM11主要调节蛋白的翻译后修饰，如磷酸化和泛素化，进而影响一些蛋白的降解［12］及PI3K/AKT等信号通路的激活［13］，参与机体免疫应答及肿瘤发生等［14］。近年来研究表明，TRIM11与人肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌和结直肠癌［15］的发生发展和预后相关。但是，TRIM11在结直肠癌发生中的生物学功能及其调控机制并不明确。近期有研究认为通过公共数据分析基因启动子区域增强子区域H3K27ac水平，能够预测基因转录激活［5-6］。通过公共数据在线分析，我们发现H3K27ac在TRIM11启动子区域富集。

本研究分析了H3K27ac和TRIM11在结肠癌组织及其癌旁正常组织中的表达情况，并在细胞水平上研究了H3K27ac和TRIM11对结肠癌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

结肠癌组织及其癌旁正常组织（＞5 cm）来源于山西省肿瘤医院，并经过医院伦理委员会批准。组织取出来后液氮冷冻-80℃保存。实验所用结肠癌细胞系均获赠于澳洲纽卡斯尔大学，为贴壁生长细胞，短期存放至-80℃，长期保存于液氮。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

用含有质量分数10%胎牛血清（以色列BI公司）和质量分数1%青链霉素混合液（北京索莱宝生物科技有限公司）的高糖DMEM（美国gibco公司）培养细胞，于37℃，体积分数5%CO2孵箱中孵育。

1.2.2 细胞转染

将TRIM11基因的cDNA克隆到载体pEX-3中，构建TRIM11过表达质粒（上海吉玛基因）。将sgRNA-NC：GGGCGAGGAGCTGTTCACCG及 sgRNA：TGCGTTGCTGTTCCAAGCCC连接到载体pGE-2（pU6gRNACas9puro）中，构建TRIM11敲低质粒（上海吉玛基因）。由脂质体转染试剂Lipo2000（美国Life Technology公司）转染结肠癌细胞，SW480、SW620细胞（TRIM11低表达细胞）转染TRIM11-Pex3（TRIM11过表达质粒），DLD1、WiDr细胞（TRIM11高表达细胞）转染TRIM11-sgR（TRIM11敲低质粒）。转染6 h换液，换为含有质量分数10%胎牛血清的完全培养基，转染后48 h收蛋白及RNA。

1.2.3 CCK-8检测细胞活性

将细胞以2000个/孔的密度接种于96孔板，待细胞贴壁后检测0 h、24 h、48 h和 72 h的吸光度值。检测时向每孔加入10 μL CCK-8试剂（上海Dojindo公司）孵箱中孵育90 min，酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.2.4 细胞集落形成检测细胞增殖

将细胞以500个/孔密度接种于6孔板，每组细胞做3个复孔。37℃，5%CO2培养两周后，PBS洗涤两次后用4%多聚甲醛固定30 min，1%结晶紫染色20 min。显微镜计数≥50个细胞集落数。

1.2.5 EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine细胞增殖检测）

将细胞以5000个/孔密度接种于96孔板，培养24 h。经过EdU标记，细胞固定化，Apollo染色，最后用荧光显微镜观察拍照。在荧光显微镜下细胞核呈蓝色，增殖细胞呈红色。

1.2.6 蛋白印迹

RIPA裂解液（上海碧云天公司）加1%蛋白酶抑制剂处理组织或细胞提取总蛋白，BCA法（北京索莱宝生物科技有限公司）测定蛋白浓度。电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗4℃孵育过夜。鼠单克隆GAPDH抗体（1∶10 000稀释；武汉三鹰生物技术有限公司），兔单克隆TRIM11抗体（1∶2000稀释；武汉三鹰生物技术有限公司），兔单克隆H3K27ac抗体（1∶500稀释；英国abcam公司，ab4729），兔多克隆H3抗体（1∶2000稀释；杭州景杰生物 PTM-1001）。二抗室温孵育1 h，山羊抗兔lgG（1∶10 000稀释；武汉三鹰生物技术有限公司），山羊抗鼠lgG（1∶10 000稀释；武汉三鹰生物技术有限公司）。使用ECL发光液（美国Millipore公司）曝光。

1.2.7 RNA提取及RT-PCR

TRIzol裂解液（美国invitrogen公司）裂解细胞或组织，氯仿抽提，异丙醇萃取RNA。Prime-ScriptTMRT Master mix（日本Takara公司，RR036A）将RNA逆转为cDNA。RT-PCR（美国Promega公司）对GAPDH及TRIM11定量检测，以 2-ΔΔCt计算 TRIM11 相对表达量。

引物序列：GAPDH-F ：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′

GAPDH-R ：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCC AAA-3′

TRIM11-F ：5′-CGCCATCTGCCTCGACTA C-3′

TRIM11-R ：5′-CTGGCTCTCCACCATCTT CTGC-3′

1.2.8 加药处理细胞

将细胞以3×104个每孔接种于6孔板，待细胞贴壁后加药。DLD1细胞用乙酰化酶抑制剂（C646，25 μmol/L）处理，SW480细胞用去乙酰化酶抑制剂混合液（1%）处理，两组细胞的空白对照均为质量分数1%二甲基亚砜（DMSO）。加药处理24小时后收蛋白及RNA。

1.3 统计学分析

运用Graphpad Prism7分析。两配对样本且数据符合正态分布，用t检验进行分析，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 H3K27ac和TRIM11在结直肠癌组织中高表达

RT-PCR结果显示，相对于癌旁正常组织，TRIM11 mRNA在结直肠癌组织中表达量明显升高（56/93）（图1（a））。Western印迹结果同样显示，在12对组织中，TRIM11蛋白在结直肠癌组织中表达量明显高于癌旁正常组织（11/12）（图1（b））。Western印迹结果表明，H3K27ac在结直肠癌组织中高表达（图1（c））。对以上12对组织中TRIM11与H3K27ac表达水平进行相关性分析。结果显示，TRIM11在结直肠癌组织中的表达与H3K27ac表达正相关（图1（d），P＜0.000 1）。

图1 TRIM11与H3K27ac在结直肠癌组织中的表达(a)TRIM11 mRNA在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的相对表达量；(b)TRIM11在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的蛋白表达水平。N:正常结直肠组织；T:结肠癌组织；(c)H3K27ac在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的蛋白表达水平；(d)TRIM11与H3K27ac表达之间的相关性分析Fig.1 Expression of TRIM11 and H3K27ac in colorectal cancer(a)The relative expression of TRIM11 mRNA in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues;(b)The expression level of TRIM11 protein in colorectal cancer tissue and its corresponding normal tissue.N:normal colorectal tissue;T:colorectal cancer tissue;(c)The expression level of H3K27ac in colorectal cancer tissue and its corresponding normal tissue;(d)The relationship analyze between TRIM11 and H3K27ac expression

2.2 TRIM11启动子区域H3K27ac富集调控TRIM11高表达

为了进一步分析H3K27ac和TRIM11的关系，通过UCSC基因组浏览器（http：//genome.ucsc.edu/）分析发现，包括结肠癌细胞在内的多种肿瘤细胞TRIM11启动子区域H3K27ac富集（2（a））。进一步通过乙酰化酶抑制剂C646处理细胞，发现C646抑制H3K27ac表达，TRIM11mRNA和蛋白水平也相应明显低于对照组（图2（b），2（c）），而去乙酰化酶抑制剂混合液处理细胞后，H3K27ac表达增高，同样TRIM11mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组（图2（d），2（e）），提示结肠癌细胞中TRIM11的高表达可能受到H3K27ac调控。

图2 H3K27ac调控TRIM11的表达(a)UCSC数据库分析TRIM11启动子区域H3K27ac富集情况；(b)Western印迹检测C646处理DLD1细胞后H3K27ac及TRIM11的表达情况；(c)qPCR检测C646处理DLD1后TRIM11 mRNA的表达情况。***代表P＜0.001;(d)Western印迹检测去乙酰化酶抑制剂混合液处理SW480细胞后H3K27ac及TRIM11的表达情况；(e)qRT-PCR检测去乙酰化酶抑制剂混合液处理SW480细胞后TRIM11 mRNA的表达情况。***代表P＜0.001Fig.2 H3K27ac regulates the expression of TRIM11(a)UCSC Genome Bioinformatics Site(http://genome.ucsc.edu/)showed high enrichment of H3K27Ac at the promoter of TRIM11;(b)The expression of H3K27ac and TRIM11 in DLD1 cells treated with C646;(c)The expression of TRIM11 mRNA in DLD1 cells treated with C646.***P＜0.001;(d)The expression of H3K27ac and TRIM11 in SW480 cells treated with deacetylase inhibitor mixture;(e)TRIM11 mRNA expression in SW480 cells treated with deacetylase inhibitor mixture***P＜0.001

2.3 TRIM11促进结肠癌细胞增殖

Western印迹和RT-PCR检测TRIM11过表达效率，结果显示过表达成功（图3（a）、3（b））。CCK8实验结果显示，过表达TRIM11细胞活性增大（图3（c））。细胞集落形成结果表明，SW480细胞转染TRIM11-Pex3后集落形成数（335±8.49）个明显高于Vector alone（对照组）组（137±9.03）个（P＜0.000 1）。SW620细胞转染TRIM11-Pex3后集落形成数（179±6.96）个明显高于Vector alone组（113±4.1）个，P＜0.000 3（图 3（d））。Edu结果显示，过表达TRIM11时增殖细胞明显增多（图3（e））。

图3 TRIM11过表达促进结直肠癌细胞增殖(a)Western印迹检测SW480、SW620细胞转染后TRIM11的表达情况；(b)qRT-PCR检测SW480、SW620细胞转染后TRIM11 mRNA的表达情况。**代表P＜0.01;(c)CCK8检测SW480（左图）、SW620（右图）细胞过表达TRIM11后细胞的增殖能力；(d)细胞集落形成实验检测SW480（上图）、SW620（下图）细胞过表达TRIM11后细胞的集落形成能力。(e)Edu检测SW480（上图）、SW620（下图）细胞过表达TRIM11后细胞的增殖能力Fig.3 TRIM11 overexpression promotes the proliferation of colorectal cancer cells(a)TRIM11 protein expression in SW480 and SW620 cells after transfection of TRIM11-pEX3;(b)TRIM11 mRNA expression in SW480 and SW620 cells after transfection of TRIM11-pEX3.**P＜0.01;(c)The proliferation ability of SW480(left)and SW620(right)cells overexpressing TRIM11;(d)The colony formation of SW480(upper)and SW620(down)cells after overexpression of TRIM11;(e)The proliferation ability of SW480(upper)and SW620(down)cells overexpressing TRIM11

TRIM11-sgR作为对照，Western印迹及RT-PCR结果显示，TRIM11-sgR可有效敲低TRIM11（图 4（a）、4（b））。CCK-8结果表明敲低TRIM11能抑制细胞活性（图4（c））。细胞集落形成实验结果显示，DLD1细胞转染TRIM11-sgR后集落形成数（164±8.05）个明显低于Vector alone组（316±8.05）个（P＜0.000 1）。WiDr细胞转染TRIM11-sgR后集落形成数（125.3±6.01）个 明 显 低 于 Vector alone组（310±14.42）个（P＜0.000 1）（图 4（d））。EdU实验结果表明敲低TRIM11增殖细胞的数量明显减少（图4（e））。提示TRIM11高表达促进结肠癌细胞增殖。

图4 敲低TRIM11抑制结直肠癌细胞增殖(a)Western印迹检测DLD1、WiDr转染sgRNA后TRIM11的表达情况；(b)qPCR检测DLD1、WiDr转染sgRNA后TRIM11 mRNA的表达情况。**代表P＜0.01，***代表P＜0.001；(c)CCK8检测DLD1（左图）、WiDr（右图）细胞敲低TRIM11后细胞的增殖能力；(d)细胞集落形成实验检测DLD1（上图）、WiDr（下图）细胞敲低TRIM11后细胞的集落形成能力；(e)Edu检测DLD1（上图）、WiDr（下图）细胞敲低TRIM11后细胞的增殖能力Fig.4 Knockdown of TRIM11 inhibits the proliferation of colorectal cancer cells(a)The expression of TRIM11 in DLD1 and WiDr cells transfected with TRIM11-sgR/NC;(b)The expression of TRIM11 mRNA in DLD1 and WiDr cells transfected with transfected with TRIM11-sgR/NC.**P＜0.01,***P＜0.001;(c)The proliferation ability of DLD1(left)and WiDr(right)cells transfected with TRIM11-sgR/NC;(d)The colony formation of DLD1(upper)and WiDr(down)cells transfected with TRIM11-sgR/NC;(e)The proliferation ability of DLD1(upper)and WiDr(down)cells transfected with TRIM11-sgR/NC

3 讨论

受我国城市化进程和人口老龄化的影响以及人们的饮食结构、生活方式的变化，我国结直肠癌发病率逐年升高，且近年来发病年轻化趋势明显，疾病防控形势较为严峻。因此，找寻与结直肠癌发生发展相关的分子标记，为结直肠癌的治疗提供分子靶点尤为重要。

H3K27ac是乙酰化修饰，在调控癌症发生发展及耐药的基因启动子区域富集。有研究表明，H3K27ac在Creb1基因启动子区域富集可促进乳腺癌的发展［16］。c-Myc基因启动子区域H3K27ac的富集与胰腺癌的发生发展相关［17］。H3K27ac在肝癌细胞系中高表达与肝癌的发生相关［18］，同时H3K27ac的表达水平在结肠癌组织中上调［19］。我们在结直肠癌组织中检测H3K27ac表达发现，相对于癌旁正常组织，H3K27ac在结直肠癌组织中表达明显增高，与之前研究结果相同。

TRIM11属于TRIM蛋白家族，是一种E3泛素连接酶，是许多类型癌症的癌基因。有研究发现，过表达TRIM11能促进前列腺癌细胞增殖［20］。在脊索瘤中TRIM11能促进PHLPP1的泛素化从而促进PHLPP1的降解，同时促进AKT的磷酸化诱导细胞增殖抗凋亡［21］。TRIM11在肝癌组织中的高表达与患者的预后不良相关，TRIM11参与了肝癌的发生发展，是肝癌治疗的潜在靶标［22］。研究表明，TRIM11在肺癌［15］、肝癌［22］、前列腺癌［20］等恶性肿瘤中发挥癌基因作用，与患者的预后不良及低生存率相关，但TRIM11在结肠癌中的报道较少且作用机制尚不明确。

本研究表明TRIM11在结直肠癌组织中高表达。对TRIM11与H3K27ac表达相关性分析发现两者呈正相关。进一步通过在线生物信息学分析，发现在TRIM11的启动子区域H3K27ac富集。为了验证H3K27ac与TRIM11表达之间的关系，分别运用乙酰化酶及去乙酰化酶抑制剂处理细胞，结果进一步证实TRIM11的表达随着H3K27ac水平的变化而变化。表明TRIM11高表达受H3K27ac富集调控。进一步通过敲减和过表达TRIM11，发现过表达TRIM11可促进结直肠癌细胞增殖。

综上所述，本研究表明，TRIM11在结肠癌的发生中发挥了癌基因的作用。H3K27ac的富集激活了TRIM11的表达。但H3K27ac调控TRIM11高表达的精确机制尚需进一步研究探讨。