杨兰，秦雪梅，徐胜，纪建军，李文成，李震宇*

（1.山西大学 中医药现代研究中心，山西 太原 030006；2.广盛原中医药有限公司，山西 大同 037300）

0 引言

芪参补气胶囊原名芪皇胶囊，由黄芪、白术（炒）、防风、西洋参4味药材制成，具有益气固表作用，用于反复外感引起的自汗易感，气短乏力，少气懒言等肺气虚证。该组方在玉屏风散基础上增加益气养阴的西洋参，不仅强化了补气功效，而且西洋参的凉性可以中和黄芪的燥性，适合儿童和成人疾病后期气阴两伤的情况下使用。已有临床研究显示该药对181例肺卫气虚、免疫功能低下的上呼吸道反复感染患者的总改善率为89.5%［1］；对120例肺气虚证病人的临床总有效率为96.7%，明显高于对照组玉屏风颗粒（85%）［2］。在多个版本的新冠肺炎治疗方案中，经典名方玉屏风散被广泛推荐用于医务工作者、密切接触人员和易感人群的日常预防。

网络药理学融合了多门新型学科，对生物系统进行网络分析，在维持网络平衡的基础上，全面系统的研究药物、靶点与疾病之间的关系和作用机制［3］。本文拟用网络药理学分析芪参补气胶囊增强机体免疫力相关的靶点，通过构建药材-主要成分-靶点-通路网络，系统预测成分与靶点之间的作用关系，结合GO（Gene Ontology)功能分析和KEGG（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes）通路富集分析，推测其发挥作用的生物学途径，为进一步阐明芪参补气胶囊增强免疫力的作用机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 芪参补气胶囊化学成分信息的收集

通过中药系统药理分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分别以“防风”“白术”“西洋参”“黄芪”为关键词检索，筛选出OB值（口服生物吸收度）≥30%、DL值（类药性）≥0.18的化学成分［4］。利用PubChem数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）检索各中药成分的化学信息，下载化合物的各成分sdf格式。

1.2 芪参补气胶囊与免疫力有关的靶标预测

在数据库 GenCLiP3（http：//ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）和 GeneCard（https：//www.genecards.org/）中以“immunity”作为关键词进行检索，设置属性为“homo sapiens”，得到与免疫力相关的基因，去掉重复基因构建疾病靶点库。再将芪参补气胶囊中每味药材的化学成分的结构和信息输入数据库Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php）中进行靶点预测，两个数据库中筛选得到的靶点去重后，得到芪参补气胶囊潜在作用靶点数据库。将芪参补气胶囊靶点库和疾病靶点库对比映射，得到重复靶点作为芪参补气胶囊与免疫力相关的作用靶点。

1.3 药材-主要成分-靶点-通路网络的构建

利用Cytoscape3.7.1软件将药材、主要成分、靶点和前20条通路进行数据处理，构建药材-主要成分-靶点-通路网络图，通过网络图直观展示主要成分与潜在作用靶点之间的关系，并分析主要成分和靶点间的度（degree）和中介度（betweenness centrality）。某节点相连的边数用节点的度值表示，节点大小正比于度值；网络中经过某一节点最短路径的数目占该网络中路径总数的比例用中介度表示，来反映此节点在整个网络中的影响程度。度和中介度值越大的节点，则在网络中影响程度越大［5］。

1.4 PPI网络图的构建

STRING数据库（https：//string-db.org/）是用于较为直观地反映蛋白质的结构和功能的平台，其相关数据主要通过实验操作，计算预测方法等途径获得［6］。将芪参补气胶囊与增强免疫力相关的靶点导入STRING数据库中，物种限定为“Homo sapiens”，获取靶点的内在互作关系，同时通过Cytoscape 3.7.1软件对靶点相互作用网络图进行构建。设置网络中节点大小反映度，颜色冷暖代表其中介度，连线的粗细反映结合律评分（Combine score）。

1.5 靶点通路分析

DAVID是免费的生物学数据库，囊括了众多生物学知识以及分析工具，通过从大批量的基因和蛋白中选取有价值的生物学信息，对基因功能和通路富集分析，包含着多种的基因标识符的DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）能够对多种多样的基因集合进行处理［7］。将芪参补气胶囊与增强免疫力相关的靶点导入DAVID数据库，进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，再应用Cytoscape 3.7.1软件中ClueGo及CluePedia插件对芪参补气胶囊与增强免疫力相关的靶点进行GO功能的免疫系统过程分析，并构建靶点-免疫系统过程网络图。

2 结果

2.1 芪参补气胶囊化学成分信息的收集

TCMSP中医药系统药理学数据库和分析平台中获取，输入关键词“防风”“白术”“西洋参”“黄芪”，得到活性成分信息，并利用PubChem数据库对其分子结构进行确证。得到符合OB≥30%和DL≥0.18的化学成分共39个。虽然黄芪中部分成分（黄芪皂苷I、II、III、IV、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、异黄烷）、白术中部分成分（白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮）、防风中部分成分（亥茅酚、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻苷）以及西洋参中部分成分（人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1）OB或DL值不符合要求，但这些成分均是这4个药材中重要的活性成分，因此也纳入后续的网络药理学分析。最终纳入成分包括，白术11个，防风22个，西洋参16个，黄芪10个（表1）。

表1 芪参补气胶囊中各药材的化合物信息Table 1 Compound information of various medicinal materials in Qishen Buqi Capsule

续表1 芪参补气胶囊中各药材的化合物信息Continue Table 1 Compound information of various medicinal materials in Qishen Buqi Capsule

2.2 作用靶点的获取以及中药-主要成分-靶点关系网络图的构建

从Swiss Target Prediction数据库、BATMANTCM数据库收集到的芪参补气胶囊主要成分作用靶点，与数据库GenCLiP 3和GeneCard数据库筛选出的与免疫力相关的靶点进行映射，得到109个共有靶点，确定为芪参补气胶囊中主要成分作用与免疫力增强有关的靶点。

采用Cytoscape 3.7.1软件建立芪参补气胶囊的药材-主要成分-靶点网络图（图1），共有164个节点，包括药材节点4个、主要成分节点51个、靶点节点109个以及876条连线，其中药材表示为橙色菱形，主要成分表示为V字形（白术主要成分表示为黄色V字形，黄芪主要成分表示为绿色V字形，防风主要成分表示为蓝色V字形，西洋参主要成分表示为粉色V字形，防风和西洋参相同成分表示为红色V字形），药物靶点表示为紫色长方形；节点之间的连线代表其相互作用。由图1可知，同一成分可以作用于不同靶点，如divaricatol可以作用于MAPK1、KDR等24个靶点，calycosin-7-O-β-D-glucoside可以作用于TNF、IL2等24个靶点，而同一靶点也可对应不同化学成分，如IL2对应formononetin、calycosin等12个成分。每味药材度值排名靠前的成分有ginsenoside rh2（人参皂苷rh2）、PQ-2、calycosin-7-O-β-D-glucoside（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、astragaloside IV（黄芪皂苷IV）、divaricatol、wogonin（汉黄芩素）、atractylenolide Ⅱ（白术内酯Ⅱ）、atractylenolide Ⅲ（白术内酯Ⅲ），共8个成分。因此，芪参补气胶囊通过多成分、多靶点协同发挥增强免疫力作用。

图1 药材-主要成分-靶点网络Fig.1 Medicine-compound-target network

2.3 PPI的网络图

对使用STRING网站得到的蛋白进行分析，得到PPI网络（图2（a））中有109个节点，2146条连线（节点表示蛋白，每条连线则表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系），网络中节点颜色反映度，节点颜色越深度越大，其中度排名前10位的节点包括TNF、VEGFA、AKT1、STAT3、ALB、MAPK3、SRC、HRAS、EGFR、IL2（网络关系见图2（b））。提示这些靶点可能在网络关系中起着较为关键的作用，可能是芪参补气胶囊用来增强免疫力的关键靶点。

图2 相关靶点的PPI网络Fig.2 PPI network of related targets

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

将相关作用靶点导入DAVID中进行GO功能分析，共得到569个GO条目（P＜0.05），其中生物过程（biological process，BP）占75%，主要涉及信号转导、RNA聚合酶II启动子转录的正调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）和凋亡过程负调控等通路；细胞组成（cell composition，CC）占10%，涉及细胞质（cytoplasm）、质膜和核等通路；分子功能（MF）占15%，涉及蛋白质结合、能量结合（ATP binding）和相同蛋白的结合等方面。各类别前20的通路具体信息如图3所示。应用ClueGo插件对芪参补气胶囊与增强免疫力相关的靶点进行GO功能的免疫系统过程分析，得到相关靶点与免疫系统过程的网络图（图4），图中有74个节点分布于2个圆形轨道上，其中内圈轨道上的节点代表芪参补气胶囊与增强免疫力相关的靶点，有58个，外圈轨道上的节点代表免疫系统过程，有16个，主要涉及B细胞活化、淋巴细胞分化、白细胞分化、骨髓白细胞分化、T细胞平衡等过程，对应免疫系统过程节点的大小反映该免疫系统过程在涉及的所有免疫系统过程中的比例；图中有273条连线代表靶点与免疫系统过程的关系，连线越粗代表两者关系越密切。

图3 芪参补气胶囊增强免疫力靶点的GO富集分析Fig.3 Analysis of GO enrichment of Qishen Buqi Capsule targets for improving immunity

图4 靶点-免疫系统过程网络Fig.4 Target-immune system process network

KEGG通路富集筛选得到芪参补气胶囊可能发挥作用的111条信号通路（P＜0.05），包括PI3KAkt signaling pathway、Hepatitis B、Proteoglycans in cancer等通路，前20条通路图如图5所示。图中圆点的大小反映的是每条通路富集靶点的数目（GeneNumber），5条通路富集的靶点较多，包括Pathways in cancer、PI3K-Akt signaling pathway、Hepatitis B、Proteoglycans in cancer、HTLV-I infection。其中，Pathways in cancer富集靶点最多，共43个（占总靶点数量的39.4%），PI3K-Akt signaling pathway富集靶点28个（占总靶点数量的25.7%），Hepatitis B富集靶点27个（占总靶点数量的24.8%）。圆点的颜色反映的是P值（pvalue）大小，颜色越接近红色，P值越小，基因的显著性越高；越接近蓝色，P值越大基因的显著性越低，其中，Pathways in cancer的P值最小（1.53×10-26），Ras signaling pathway的P值最大（5.87×10-11）。

图5 芪参补气胶囊增强免疫力靶点的KEGG通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of KEGG pathway target of Qishen Buqi Capsule for enhancing immunity

2.5 药材-主要成分-靶点-通路网络图构建

将药材、成分、靶点和通路节点的相关信息导入Cytoscape 3.7.1软件中，构建药材-主要成分-靶点-通路网络图（图6），图中包括184个节点，其中4个药材节点、51个主要成分节点、109个靶点节点和20个通路节点以及1336条连线。药材表示为橙色菱形，主要成分表示为V字形，（白术主要成分表示为黄色V字形，黄芪主要成分表示为绿色V字形，防风主要成分表示为蓝色V字形，西洋参主要成分表示为粉色V字形，防风和西洋参相同成分表示为红色V字形），药物靶点表示为紫色长方形，前20条通路表示为墨绿色六边形；节点间的连线代表其相互作用。

图6 药材-主要成分-靶点-通路网络Fig.6 Medicine-compound-target-pathway network

2.6 芪参补气胶囊各药材的作用靶点分析

芪参补气胶囊涉及增强免疫力的109个靶点中，黄芪、白术、防风、西洋参均各有贡献（图7，韦恩图）。其中，黄芪涉及68个靶点和111条KEGG通路，特有的靶点有9个，分别是PON1、FGFR3、ALB、CD274、CCR3、BIRC5、SELL、MIF、BTK；白术涉及54个靶点和109条KEGG通路，特有的靶点有4个，分别是NOS3、IL1B、PGR、PTPRC；防风的78个靶点对应108条KEGG通路，特有的靶点有7个 ，分 别 是 PRF1、CASP1、VCAM1、PSEN1、CASP8、NLRP3、FCER2；西洋参涉及80个靶点和111条KEGG通路，特有的靶点有7个，分别是TLR7、CCR5、XIAP、STAT5B、STAT1、CX3CR1、PRTN3。芪参补气胶囊在玉屏风的基础上增加了西洋参，因此，西洋参的这7个特有靶点是芪参补气胶囊相对于玉屏风散的特有靶点。

图7 芪参补气胶囊潜在靶点的Venn图Fig.7 Venn diagram of potential target in Qishen Buqi Capsule

3 讨论

本研究利用网络药理学分析芪参补气胶囊增强免疫力的作用机制，利用TCMSP平台通过设定OB≥30%、DL≥0.18两个参数筛选各个药材的主要成分，得到白术主要成分11个，防风主要成分22个，西洋参主要成分16个，黄芪主要成分10个，所构建的药材-主要成分-靶点-通路关系网络图由4个药材节点、51个主要成分节点、109个靶点节点和20个通路节点组成。

与玉屏风散相比，芪参补气胶囊增加的7个特有靶点（TLR7、CCR5、XIAP、STAT5B、STAT1、CX3CR1、PRTN3）部分与免疫相关。研究显示STAT5B缺乏或突变导致人类自然杀伤细胞成熟失调和裂解功能受损，也会损害T细胞体内平衡，从而影响人体的自身免疫［8］。Majoros等发现信号转导和转录激活因子1（STAT1）通过引导转录反应到干扰素（IFNs），在天然免疫系统中起着至关重要的作用［9］。TLRs是一种膜型蛋白，被归类为模式识别受体（PRRs），对天然免疫和适应性免疫反应至关重要，可调节宿主的免疫反应而引起广泛关注，TLR7就是其中的一类受体［10］。

已有研究显示汉黄芩素介导小鼠白细胞的细胞毒性，激活NK细胞和巨噬细胞的活性，可提高NK细胞的杀伤作用和巨噬细胞的吞噬作用。汉黄芩素可呈剂量依赖性增加白细胞培养基中细胞因子IL-1α和TNF-α水平，增加IL-1α和TNF-αmRNA的转录水平，抑制NF-κB的p65和I-κB的表达［11］。唐冕等指出黄芪皂苷能促进细胞吞噬功能和增加溶酶体水解酶含量，并增强处理和传递抗原的能力，抑制腹腔巨噬细胞产生IL-1和TNF-α［12］。人参皂苷Rh2可提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能及血清溶血素抗体的生成能力，提高小鼠NK细胞杀伤活性和IL-2活性［13］。Gharibi等发现在免疫系统中，淋巴细胞表达的大多数细胞因子受体，包括IL-6、IL-10、IL-21、IL-23和干扰素（IFNs）的受体，都能激活STAT3。提示它是淋巴细胞生物学、调节免疫反应和自身免疫的重要因素［14］。Zenke等发现AKT1是PI3K-AKT信号转导的主要效应分子，通过抑制NF-κB激活和IRF3活性（独立于其激酶活性），从而明显抑制Toll样受体（TLR）介导的MyD88依赖性信号传导和Toll/IL-1R结构域的适配器诱导的IFN-β（TRIF）依赖性信号传导，从而抑制炎症而提高自身免疫力［15］。Toll-like receptor（TLRs）通过识别病原体或病原体相关分子模式的保守成分，参与天然免疫反应，TLRs在巨噬细胞和树突状细胞中高度表达，树突状细胞是天然免疫反应的主要参与者，也是适应性免疫反应的主要发起者。因此，TLRs的激活是先天免疫反应对入侵病原体的关键因素，但也指导随后持续的适应性免疫反应的类型和程度［16］。Influenza A的信号被识别后，宿主细胞内3种模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）介导的天然免疫信号通路被激活，这些通路调控宿主干扰素（IFN）等细胞因子基因的转录，从而分泌相关细胞因子如Ⅰ型干扰素和Ⅲ型干扰素。干扰素与相应的干扰素受体结合，激活Janus酪氨酸激酶-信号转导子和转录活化子（Janus tyrosine kinasessignal transducers and activators of transcription，JAK-STAT）信号通路。活化的JAK-STAT信号通路启动一系列干扰素刺激基因的表达，从而调节着机体的免疫功能［17］。因此，本研究通过网络药理学预测出的芪参补气胶囊成分-靶点-通路之间的相互作用部分结果可以得到现有文献报道的确证。

综上所述，本研究通过网络药理学方法从化学成分、作用靶点、信号通路的角度分析了芪参补气胶囊增强免疫力的可能生物学机制，发现芪参补气胶囊中的汉黄芩素、黄芪皂苷、人参皂苷Rh2等8个化合物，STAT3、AKT1、ALB等10个靶点，以及PI3K-Akt signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、Influenza A等20条通路与芪参补气胶囊的免疫增强作用密切相关，从而初步推测了芪参补气胶囊是通过多成分、多靶点、多通路的复杂作用机制而发挥作用，为进一步深入研究其药效物质基础及作用机制奠定了基础。但是，网络药理学的预测结果需要在后续研究中通过实验进行验证。