岳慧英，杨素萍，赵春贵*

（1.山西中医药大学 基础医学院，山西 晋中 030619；2.华侨大学 生物工程与技术系，福建 厦门 361021）

0 引言

紫细菌（purple bacteria）是不产氧光合细菌中的一个重要类群，其光合单元由一系列定位在内质膜（intracytoplasmic membrane，ICM）上的色素蛋白复合体构成，主要包括反应中心（reaction center，RC）、外周捕光复合体（peripheral light harvesting complex，LH2）和核心捕光复合体（core light harvesting complex，LH1）。LH2负责捕获光能，通过LH1传递到RC进行原初光化学反应。自20世纪80年代，Deisenhofer等首次通过十二烷基二甲基氧化胺（LDAO）溶解膜蛋白，成功在3 Å水平上解析了绿色绿芽菌（Blastochloris，Blc.viridis）RC 的晶体结构，从此膜蛋白的研究进入了崭新的阶段［1］。迄今为止，已经从不同的紫细菌中共获得125个RC、5个LH2、1个LH3、10个RC-LH1的高分辨率晶体结构（来自PDB数据库），其结构和功能的研究也取得了极大的进展［2-3］。

类似于 LH2，LH1是由 12～17个 αβ异二聚体组成的同心圆环状结构，RC按1∶1化学计量比位于LH1同心圆中间。LH1有两种环绕RC的排布方式，一种是LH1αβ亚基聚集成封闭的桶状结构环绕RC［4-5］；另外一种是LH1形成开放的环围绕RC，其中1个LH1αβ亚基被1个W蛋白［6］、X 蛋白［7］或者是 pufX 蛋白［8］取代，形成缺口以利于电子传递。RC-LH1晶体结构显示每个LH1αβ亚基非共价结合2个细菌叶绿素分子（bacteriochlorophyll，BChl）和 1个类胡萝卜素分子，BChl分子位于周质侧形成环状聚集体，产生约 875 nm 的特征吸收峰［9］，称 作B875。然而 Roseiflexus castenholzii 4.10 Å 分辨率的RC-LH1晶体结构显示每个LH1αβ亚基还结合另外1个B800 BChl分子［7］。解决上述争议期待于高分辨率的LH1的晶体X射线衍射结构的获得。通过光谱学手段对LH1的功能特征已有深入研究，为什么LH1晶体结构还未得到，主要原因是LH1结构不像LH2稳定，从ICM上分离纯化过程中易破坏，另外在结晶过程中LH1的溶解性及结构稳定性也易于受到去垢剂的影响。

色素蛋白复合体是膜整合蛋白，同时具有疏水端和亲水端，在制备过程中需要采用去垢剂分子取代脂膜分子而结合在蛋白复合体的疏水表面，从而将其从ICM上解离下来处于溶液状态。然而使用去垢剂增溶ICM时由于天然脂膜相互作用改变，容易引起色素蛋白复合体失活［10］。Odahara等［11］比较分析了19种去垢剂分子对7种色素蛋白复合体稳定性和溶解性的影响，结果表明来自Rhodobacter（Rba.）sphaeroides、Rba.capsulatus的 LH2和 来 自 Rba.sphaeroides、Rba.capsulatus、Blc.viridis的 RC 在几乎所有测试浓度的去垢剂中均保持结构稳定，而 Phaeospirillum rubrum和 Blc.viridis的RC-LH1的结构稳定性则在不同去垢剂中存在差异，在0.5%LDAO（V/V）中极易变性，表明这种带有极性亲水头部的小分子去垢剂易于改变LH1的构象。LDAO是一种温和型两性去垢剂，常用于从光合细菌的ICM上制备色素蛋白复合体。通常而言，纯化LH2时采用1%LDAO浓 度［12］，纯 化 RC 时 采 用 0.25%～1% 浓度［13-14］，纯 化 LH1 采 用 0.05%～0.45% 浓度［9，15］，LDAO 浓度的选择因菌属而异。较高浓度的LDAO会扰乱色素蛋白复合体中亚基堆积，进而影响色素蛋白复合体的结构及稳定性。Palazzo等［16］研究表明将LDAO浓度由0.025%提升至0.5%，Rba.sphaeroides RC的熔温度将由49℃降低到42℃，表明RC的天然构象和变性构象之间的转换依赖于LDAO的浓度。赵艮贵等［17］研究表明采用不同浓度LDAO处理去垢剂纯化的LH2，会导致B850-BChl解离。然而关于LH1制备及LDAO对LH1结构影响的报道较少，Rosenow等［18］报道从Rhodospirillum centenum中分离制备LH1时采用1%LDAO增溶1 h，然而在Rhodobacter属中分离LH1时LDAO浓度需要调低至0.05%。所以总体来说LDAO对LH1的具体作用非常迷惑。本实验室对Rba.azotoformans R7研究中发现用体积分数为1%LDAO处理光合膜时，LH1在875 nm的BChl Qy特征峰的强度显著降低，通过进一步色素蛋白复合体的分离纯化，没有分离到LH1或者RC-LH1复合体，这是由于LDAO对ICM上的LH1进行了可逆性解离还是彻底破坏了LH1的结构？在色素蛋白复合体纯化时，LDAO浓度没有统一的标准，对ICM增溶时不同浓度LDAO以及同一浓度LDAO对LH1影响是否存在一定规律？

本实验针对以上疑惑进行研究，并探讨了LDAO与ICM上LH1的相互作用规律，对于理解去垢剂与色素蛋白复合体相互作用机制增加了新的内容，可为研究LH1的稳定性、纯化过程、储存以及在结晶过程中选择合适的去垢剂分子及浓度提供参考，进一步为光合作用机理的阐明奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

固氮红细菌（Rhodobacter azotoformans R7），16SrRNA序列GeneBank登录号EU604757，本实验室分离鉴定保存。

LDAO（十二烷基二甲基氧化胺，Fluka）；DEAE-纤维素 32（DEAE-32，Whatman）；Tris（三羟基氨基甲烷，Whatman）；自动蛋白核酸纯化仪（ÄKTA，Amersham Biosciences）；电泳仪（DYC2-24DN，北京市六一仪器厂）；立式高速冷冻离心机（CS150GXL，Hitachi）；高速冷冻离心机（5417R，Eppendorf）；紫外可见分光光度计（UV-3200，MA-ADA）。

1.2 样品制备及处理

按文献［19］方法配制培养基，于30℃3000 Lux光照厌氧静置培养7 d。按照文献［20］方法制备ICM，8000 g离心收集菌体，用pH 8.0、10 mmol/L Tris-HCl缓冲液洗菌体3次，4℃黑暗条件下（以下操作均在此条件下进行）压力破碎细胞（4.5 kpsi，3次），10 000 g离心30 min，取上清液，经100 000 g离心1 h，收集沉淀，缓冲液洗涤2次，收集沉淀，即得ICM。分别以体积分数为0.05%、0.1%、0.5%和1%LDAO增溶400 min，监测吸收光谱变化，并以A875作为监测指标，绘制A875的动力学变化曲线。脱除LDAO按照参考文献［21］，在4℃黑暗条件下用pH 8.0、10 mmol/L Tris-HCl缓冲液对样品透析24 h，期间更换8次透析外液，收集样品进行光谱检测。

1.3 色素蛋白复合体的分离纯化

LDAO处理后的样品通过硫酸铵盐析和阴离子交换层析（ÄKTA purifier 100）进行色素蛋白复合体的分离纯化［12］，并通过SDS-PAGE以及吸收光谱检测纯度。

图11 %(V/V)LDAO增溶前后内质膜在近红外区的吸收光谱和内质膜上LH1/LH2的摩尔比Fig.1 Absorption spectra of intracytoplasmic membrane before(black line)and after(grey line)1%(V/V)LDAO treatment,the molar ratios of LH1/LH2 were calculated from the absorption spectra of membranes after spectral deconvolution[25]

1.4 吸收光谱测定

RC和LH2的吸收光谱测定，在TL（pH 8.0 10 mmol/L Tris-HCl，0.1%，V/V，LDAO）缓冲液中，用光程1 cm石英比色杯，于UV-3200分光光度计上室温测定，扫描波长范围为200 nm～1000 nm。测定RC-LH1吸收光谱时TL缓冲液中LDAO浓度调整为0.01%。

1.5 SDS-PAGE分析

采用丙酮沉淀法［22］浓缩蛋白，考马斯亮蓝法［23］定蛋白浓度，SDS-PAGE法［24］测定蛋白分子量，电泳条件为浓缩胶恒压50 V约40 min，分离胶恒压100 V约80 min。

2 结果与分析

2.1 LDAO对原位LH1吸收光谱的影响

图1中黑色实线所示是ICM的近红外区吸收光谱，主要呈现800 nm和850 nm吸收峰，760 nm和875 nm的肩峰。其中760 nm肩峰是RC中脱镁细菌叶绿素吸收峰，800 nm吸收峰由LH2中B800-BChl聚集环和RC中辅助BChl贡献，850 nm吸收峰由LH2中B850-BChl聚集环贡献，875 nm肩峰是LH1中B875-BChl聚集环的特征吸收峰［16］。4℃黑暗条件下，加入1%LDAO后，A800/A850的比值升高，850 nm吸收峰发生蓝移，表明色素蛋白复合体从ICM上分离，其中875 nm肩峰消失（图1灰色实线），表明1%LDAO扰乱了ICM上LH1中B875-BChl聚集环的结构。参照文献［25］估算LH2/LH1的摩尔比，可以计算出1%LDAO增溶前ICM上LH1/LH2摩尔比为1.06，增溶后TL溶液中LH1/LH2摩尔比降低至0.17，800 nm和850 nm吸收峰存在，并且结合文献［12］表明LH2在1%LDAO中保持结构完整性，LH1/LH2摩尔比下降预示着LH1结构发生了破坏。那么，LDAO造成LH1的可逆性解离还是破坏了LH1的结构？本文接下来分析了脱除LDAO后ICM的吸收光谱的变化。

2.2 脱除LDAO后原位LH1吸收光谱的变化

文献［26］报道，LH1环状结构可以解离为在820 nm具有吸收峰的αβ·2BChl，进一步解离产生具有760 nm吸收峰的游离的BChl分子。本文针对上述1%LDAO增溶作用后的ICM溶液透析处理24 h以脱除LDAO，试图分析脱除LDAO后该解离过程是否可逆。透析过程中，体系的体积增大，导致溶液中ICM浓度下降，图2（a）显示800 nm和850 nm吸收峰的强度下降，但是LH1在875 nm处的吸收峰并无恢复。通过稀释倍数的换算，绘制透析过程中LH1的特征峰A875的变化图，如图2（b）所示A875未发生明显变化，表明LH1的结构受到1%LDAO的不可逆破坏。1%LDAO增溶ICM导致LH1特征吸收峰的消失，是否由于LDAO浓度过大引起，鉴于此，本文分析了LDAO浓度对ICM上LH1吸收光谱的影响。

图2 脱除LDAO时内质膜吸收光谱(a)和875 nm吸光度值A875(b)动力学分析Fig.2 Dynamic analysis of intracytoplasmic membrane absorption spectra(a)and A875(b)with removal of LDAO

2.3 不同浓度LDAO对原位LH1破坏的动力学分析

不同浓度LDAO对ICM吸收光谱的影响如图3（a）所示，随着LDAO浓度增大，LH1在875 nm特征峰强度降低，760 nm游离BChl Qx峰逐渐升高，表明不同浓度LDAO对LH1的结构均造成了破坏。图3（b）所示加入LDAO 30 min后875 nm吸收峰强度迅速下降，之后随着作用时间增加，875 nm的吸收持续下降，直至达到平衡。0.5%LDAO作用时达到平衡需要约250 min，1%LDAO时需要较短的时间约180 min。平衡时875 nm吸收峰强度同LDAO浓度成反比，表明LH1复合体结构破坏程度同LDAO的浓度呈正相关。

图3 不同浓度(V/V)LDAO对内质膜吸收光谱(a)和875 nm吸光度值(b)的影响Fig.3 Effect of LDAO concentration on absorbance spectra of intracytoplasmic membrane(a)and the intensity of 875 nm peak(b)

2.4 LDAO作用下色素蛋白复合体的纯化效果

综合上述实验结果，采用1%LDAO增溶破壁上清120 min，然后进行40%、60%和80%（g/L）硫酸铵分级分离和DEAE-32阴离子交换层析，40%～60%和60%～80%盐析组分经离子交换层析，于0.15 mol/L～0.2 mol/L NaCl洗脱获得LH2，其吸收光谱见图4（a）。LH2呈现典型的BChl 377 nm Soret带、590 nm Qx带、800 nm 和850 nm Qy带吸收峰，以及典型的450、480和512 nm球形烯系类胡萝卜素吸收峰，与Rhodobacter属文献［2］中报道的典型LH2吸收光谱有1 nm～2 nm位移的细微差别。0～40%盐析组分经离子交换层析，在0.2 mol/L～0.25 mol/L NaCl洗脱获得RC，其吸收光谱见图4（b）。RC在近红外区呈现典型的760、800和850 nm三指峰，另外还有368 nm和598 nm BChl吸收峰，448、475和508 nm类胡萝卜素吸收峰。1%LDAO处理ICM时造成了LH1不可逆的破坏，经盐析组分和离子交换层析分离没有获得LH1。采用0.05%LDAO增溶后上清，缓冲液为TL（10 mmol/L，pH 8.0，0.01%LDAO），按照上述步骤进行色素蛋白复合体分离纯化，60%～80%盐析组分经DEAE离子交换层析没有检测到色素蛋白复合体，0～40%和40%～60%盐析组分经DEAE离子交换层析，0.25 mol/L～0.3 mol/L NaCl洗脱获得RC-LH1。依据A855估算RCLH1的相对含量，0～40%盐析中RC-LH1含量约占RC-LH1总含量的85%。图4（c）显示RCLH1在近红外区具有一个强的855 nm吸收峰和一个弱的800 nm吸收峰，其中855 nm吸收峰是由LH1中环状聚集的B875 BChl分子产生的Qy吸收带，该吸收峰与文献报道Rhodobacter属LH1相比发生了约20 nm的蓝移。根据Drews等［26-27］报道，LH1在去垢剂中容易发生可逆解离，LH1 855 nm吸收峰意味着LH1环状结构在分离纯化过程中发生了解离，产生了αβ·2BChl的聚集体，例如 α2β2·4BChl。

图4 纯化色素蛋白复合体的吸收光谱。(a)LH2;(b):C;(c)RC-LH1Fig.4 Absorption spectra of purified pigment protein complexes.(a)LH2;(b)RC;(c)RC-LH1

2.5 色素蛋白复合体的蛋白质分析

色素蛋白复合体SDS-PAGE分析如图5所示，图5（a）中显示RC-LH1（L1）在31 kDa～66 kDa范围内有4条电泳条带，分别对应RC的H、L、M亚基和细胞色素C亚基，在14.4 kDa以下接近前沿有2条分子量接近的蛋白条带，对应LH1的 α和 β两个亚基。RC（L2）在31 kDa～66 kDa之间有3条带，对应RC的H、L、M亚基，而在其他分子量范围无条带。图5（b）中显示LH2（L3）在14.4 kDa以下有2条分子量接近电泳条带，与Rba.azotoformans中LH2分子量约为6 kDa的α和 β 两个亚基相对应［12］。

图5 三种纯化色素蛋白复合体的SDS-PAGE(a)RC-LH1(L1)和RC(L2);(b)LH2(L3);M:MakerFig.5 Electrophoresis patterns of proteins from three kinds of pigment protein complexes.L1:RC-LH1;L2:RC;L3:LH2;M:Maker

3 讨论

LH1围绕RC形成封闭或者开放的环状结构，LH1将LH2捕获的光能传递给RC，RC中进行光化学反应。通过各种光谱学手段对LH1的能量传递活性及影响能量传递活性的蛋白亚基或者色素分子开展了深入的研究，然而对LH1结构模型的认识仍基于RC-LH1晶体结构，迄今尚无LH1高分辨率晶体结构获得。

作为膜蛋白，LH1的分离纯化过程比较复杂，需要采用去垢剂将其从ICM上解离下来。首先LH1的结构不像LH2稳定，在分离过程中结构容易遭到破坏，其次，LH1环绕RC，分离过程中需要将中间的RC剔除，因此获得纯度较高的有活性的LH1存在困难。Law等［28］采用1%LDAO增溶15 min，通过40%（g/L）硫酸铵盐析将RC和LH1分离，超速离心（197 000 g，1 h，4℃）后获得的上清液即为Rhodobium marinum DSM 2698的 LH1。Michalik等［9］报道在Phaeospirillum rubrum S1中，ICM经0.45%（V/V）LDAO增溶，然后超速离心将RC和LH1分离，用2.35%OG（V/V）继续增溶，离心取上清液进行DEAE离子交换层析，获得纯化的LH1组分。上述两个菌种的共同点是仅含RCLH1，所以LH1制备过程较简单，即便如此，比较发现两个菌株采用了不同浓度的LDAO增溶，在Phaeospirillum rubrum S1中还使用OG重复增溶，表明紫细菌LH1的结构稳定性存在种属差异。本文采用1%LDAO增溶Rba.azotoformans R7 ICM时，其LH1遭到不可逆破坏，分离纯化没有获得LH1或者RC-LH1，而本课题组采用同样浓度LDAO（1%）增溶Rps.palustris CQV97 ICM时，LH1未被破坏，经分离纯化获得了RC-LH1，表明这两个菌株中的LH1在LDAO溶液中稳定性不同。大部分紫细菌同时含有LH2和RC-LH1，LH1的制备过程更为复杂，要先去除LH2，然后再将LH1和RC分离。鉴于LH1构象不稳定性，本文分析了不同浓度LDAO与Rba.azotoformans R7原位膜LH1的相互作用规律，0.05%、0.1%、0.5%和1%LDAO均对LH1造成不可逆破坏，1%LDAO增溶对LH1的破坏最严重，本文对1%LDAO处理样品进行分离纯化仅获得LH2和RC，表明LH1全部破坏或者残余量低，因此，常采用1%LDAO分离纯化LH2。0.05%LDAO增溶时LH1破坏程度较小，进一步分离纯化获得RC-LH1，表明大部分LH1从ICM上解离下来，只是LH1仍与RC结合，需要在不破坏LH1活性和结构的前提下将LH1环状结构中间的RC去除，方能获得纯化 LH1。Picorel等［29］报道在 Rba.sphaeroides 2.4.1中采用0.5%TritonX-100（V/V）和0.5%SDS（V/V）增溶处理，10%（g/L）硫酸铵盐析获得以LH1为主（掺杂有不同比例的LH2）的沉淀组分，即使经多次重复硫酸铵盐析（2%，g/L）以消除LH2，实验结果也常不理想。目前，Rhodobacter中LH1多来自Rba.sphaeroides突变株，如 M2192［30-31］，DD13//LH1［32-34］，L3［35］等，这些突变株的共同特点是缺失了编码LH2和RC蛋白亚基的基因，因此细胞只能合成少量LH1。即使从突变株中可以分离纯化获得LH1，由于LH1稳定性差，结晶也存在困难。

本文系统地分析了LDAO与Rba.azotoformans R7原位膜LH1相互作用的规律。原位膜LH1与LDAO作用后，自身结构发生较大程度破坏，而并非可逆性解离，LH1破坏程度与LDAO浓度成正相关。在制备色素蛋白复合体过程中，常用的制备LH2的LDAO浓度（1%）增溶膜蛋白时对LH1的结构造成不可逆的破坏，进一步分离纯化仅获得RC和LH2；在较低LDAO浓度（0.05%）时，LH1破坏程度较小，分离纯化获得RC-LH1。以上研究为LH1的纯化提供了依据，为理解去垢剂与色素蛋白复合体相互作用机制增加了新的内容。