氮素形态对野牛草生长及氮素吸收利用的影响

2022-11-23邹博坤王欣铭褚章杉黄馨慧陈雨峰钱永强

草业学报 2022年11期

邹博坤，王欣铭，褚章杉，黄馨慧，陈雨峰，钱永强

（中国林业科学研究院生态保护与修复研究所，国家林业和草原局草原研究中心，北京 100091）

氮是植物生长、发育和抵抗生物和非生物胁迫的重要元素，对植物氨基酸、蛋白质、核酸、叶绿素、各种初级和次生代谢物以及激素的生物合成非常重要［1］。植物以硝酸盐、铵、尿素、亚硝酸盐或这些形式的组合形式吸收氮，硝酸盐经硝酸还原酶（nitrate reductase，NR）和亚硝酸还原酶（nitrite reductase，NiR）还原成铵根，然后被谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）/谷氨酸合酶（glutamate synthase，GOGAT）循环同化到各种途径［2-3］。不同植物偏好不同的氮素形态，在农业上，一般认为旱地植物喜硝，水淹土种植的作物喜铵［4］。对不同的植物开发有针对性的氮肥配施方案，能够明显提高氮肥利用效率，提高农业生产经济效益。在自然环境下，植物氮素吸收偏好的种间差异可以为植物有效划分有限的土壤氮提供一种机制，从而促进物种共存和维持生物多样性［5］。植物对不同氮素形态的吸收偏好也是一种竞争优势，特别是在营养有限的环境中，可以与植物总氮含量相结合用来解释不同育力草地上草种竞争优势的变化［6］。

野牛草（Buchloe dactyloides）是禾本科（Gramineae）画眉草亚科（Eragrostoideae）野牛草属（Buchloe）多年生草本植物，因其具有良好的耐旱、耐寒和耐贫瘠特性，20世纪40年代，作为水土保持植物引入我国，并在华北地区作为生态修复草和草坪草广泛应用［7］。传统野牛草草坪管理中，一般以尿素为氮源，施用量为75～150 kg·hm-2［8］，随着氮肥用量的增加，野牛草叶片叶绿素含量升高，草坪色泽、密度和综合质量评分均提高，但过度或频繁地施肥会促使杂草生长，对野牛草几乎没有积极影响［9-10］。尿素是一种速效氮肥，大部分转化成氨挥发或被淋溶，利用率不足35%，造成投入的浪费和环境污染。常见的氮肥种类包括尿素、硝态氮、铵态氮和硝铵混合态氮，关于氮素形态对作物或蔬菜的影响已有较多研究，关于氮素对野牛草影响的研究主要集中在施氮量对野牛草产量、有机物积累和草坪质量的影响方面，而氮素形态对野牛草生长和氮素吸收利用影响的研究鲜见报道。野牛草有广阔的应用前景，了解其对氮素的吸收偏好对制定合理的氮肥管理方案、降低野牛草养护成本、提高生产效益、有效保护草地生态环境有积极作用。本研究以两个野牛草商业品种‘Sundancer’和‘Texoka’为试验材料，分析氮素形态对野牛草生长特性、氮素利用和氮同化相关酶活性的影响，探究野牛草对氮素的吸收偏好，为野牛草合理高效施用氮肥提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以野牛草商业品种‘Sundancer’、‘Texoka’饱满的种子为试验材料。

1.2 试验设计

试验采用二因素随机区组设计，设置2个野牛草品种，分别为‘Sundancer’和‘Texoka’；设置5种氮素形态，分别为不施氮（N0）、尿素（N1）、Ca（NO3）2·4H2O（N2）、NH4Cl（N3）和NH4NO3（N4），共5个处理，每个处理3次重复。

1.3 试验方法

2021年4 月，取直径16.5 cm，高17.5 cm的花盆（带托盘，容积约3.8 L），在盆中装入冲洗干净的蛭石（2～5 mm，约0.8 kg），基础养分：有机质含量4.18 g·kg-1，硝态氮含量31.9 mg·kg-1，铵态氮含量10.8 mg·kg-1，碱解氮含量52.1 mg·kg-1，速效磷含量4.0 mg·kg-1，速效钾含量115.2 mg·kg-1，pH 6.82，电导率493 μS·cm-1。按每盆3 g的播种量取野牛草种子，用5%次氯酸钠溶液浸泡5 min，期间不断搅动，冲洗干净后流水浸泡48 h。播种后用塑料膜覆盖盆口，发芽后揭开。施氮量按纯氮计500 mg·kg-1，以1/2浓度缺氮改良型霍格兰营养液为其他营养元素来源［11］，营养液组分为：MgSO4241 mg·L-1，K2SO4435 mg·L-1，KH2PO4136 mg·L-1，CaCl2444 mg·L-1，Fe-citrate 5.1 mg·L-1，MnCl20.56 mg·L-1，ZnSO40.06 mg·L-1，CuSO40.025 mg·L-1，H3BO36.2 mg·L-1，NaMoO4·2H2O 0.25 mg·L-1，CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1。将配制好的缺氮改良型营养液分为5组，第1组为缺氮处理组（N0），另外4组分别加入尿素：214 mg·L-1（N1），Ca（NO3）2·4H2O：771.4 mg·L-1（N2）、NH4Cl：382.1 mg·L-1（N3）和NH4NO3：285.7 mg·L-1（N4）。营养液混合后分8次施入盆中，每7 d每盆浇营养液0.5 L，连续浇8周，渗出到托盘中的液体倒回盆中，避免养分流失。本试验在中国林业科学研究院科研温室中进行，培养条件为自然光光照，温度为白天28℃，夜晚20℃。

1.4 测定指标

参照《土壤农化分析》［12］测定基质pH、电导率、有机质、碱解氮、硝态氮、铵态氮、速效磷和速效钾含量。处理一周后，每周相同时间测定自然株高，8周后于上午10：00取样，将根系完整取出，冲洗干净，地上部和地下部分开，测定鲜重。部分样品液氮冷冻后-20℃保存，其余样品105℃杀青30 min后80℃烘干至恒重。采用凯氏定氮法测定总氮含量，采用硝基水杨酸法测定硝态氮含量［13］，采用改良茚三酮比色法测定铵态氮含量［14］。硝酸还原酶活性、谷氨酰胺合成酶活性和谷氨酸合酶活性采用购自索莱宝公司的酶活性试剂盒测定。氮素积累量、氮肥利用率（nitrogen use efficiency，NUE）［15］计算方法如下：

式中：U为施氮作物吸氮量；U0为不施氮作物吸氮量；F为施氮量。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2010对原始数据进行整理。采用SPSS 19.0对数据进行分析，对不同形态氮素不同品种野牛草的生长特性、氮素积累量、氮肥利用率的影响进行双因素方差分析（two-way ANOVA），Duncan法进行多重比较，Origin 2021进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

参照文献［16］计算不同处理各指标隶属函数值μ（Xj），计算公式如下：指标与生长特性呈正相关：

指标与生长特性呈负相关：

式中：Xj表示i处理第j个指标值，Xmin表示第j个指标的最小值，Xmax表示第j个指标的最大值。

用下列公式计算标准差系数Vj：

用下列公式计算各指标权重Wj：

式中：Wj表示第j个指标的权重，m表示有m个指标。

用下列公式计算各处理隶属度值D：

2 结果与分析

2.1 氮素形态对野牛草生长的影响

2.1.1 氮素形态对野牛草株高的影响两个品种在施氮条件下株高显著大于不施氮条件（P＜0.05），发芽后14 d内为快速生长期，14 d后生长速率放缓。发芽56 d时，‘Sundancer’在硝酸钙处理下株高显著高于其他处理（P＜0.05），是不施氮处理的1.89倍，‘Texoka’在硝酸铵（N4）处理下株高显著高于其他处理（P＜0.05），是不施氮（N0）处理的1.74倍。不同处理下‘Texoka’发芽后56 d的平均株高为196.05 mm，‘Sundancer’发芽后56 d的平均株高为179.95 mm，‘Texoka’的平均株高显著高于‘Sundancer’（P＜0.05），表明在株高方面有较大的品种间差异（表1）。

表1 氮素形态对野牛草株高的影响Table 1 Effects of different nitrogen forms on height of B.dactyloides（mm）

2.1.2 氮素形态对野牛草生物量及根冠比的影响两个品种在施氮条件下的地上部生物量均显著大于不施氮条件下（P＜0.05），表明氮素有利于野牛草地上部干物质积累。地上部、地下部生物量及根冠比在4种不同氮素形态处理下均无显著差异（P＞0.05），表明氮素形态对野牛草地上部、地下部生物量及根冠比无显著影响（图1和图2）。在不施氮处理下，‘Sundancer’根冠比为70.51%，‘Texoka’根冠比为65.41%，均是其他施氮处理的3倍以上，表明低氮会促使野牛草将有限的营养物质优先供给根系生长（图2）。

图1 氮素形态对野牛草生物量的影响Fig.1 Effects of different nitrogen forms on biomass of B.dactyloides

图2 氮素形态对野牛草根冠比的影响Fig.2 Effects of different nitrogen forms on root-shoot ratio of B.dactyloides

2.2 氮素形态对野牛草氮素利用的影响

2.2.1 氮素形态对野牛草硝态氮含量的影响两个品种的地上部硝态氮含量均表现为硝酸钙（N2）＞尿素（N1）＞氯化铵（N3）＞硝酸铵（N4），表明硝态氮处理有利于野牛草地上部硝态氮积累。两个品种在硝酸铵处理下与不施氮时地上部硝态氮含量均无显著差异（P＞0.05），表明混合态氮相较于单一形态氮不仅不利于地上部硝态氮积累，还有抑制作用。两个品种的地下部硝态氮含量均表现为尿素（N1）＞硝酸铵（N4）＞硝酸钙（N2）＞氯化铵（N3）＞不施氮（N0），表明尿素和混合态氮更有利于野牛草地下部硝态氮积累（图3）。

图3 氮素形态对野牛草硝态氮含量的影响Fig.3 Effects of different nitrogen forms on nitrate nitrogen content of B.dactyloides

2.2.2 氮素形态对野牛草铵态氮含量的影响‘Sundancer’地上部铵态氮含量表现为氯化铵处理时最高，分别是硝酸铵、硝酸钙和尿素处理的1.29、1.67和1.69倍，表明铵态氮更有利于‘Sundancer’地上部铵态氮积累。氯化铵和硝酸铵处理下，‘Texoka’地上部铵态氮含量无显著差别（P＞0.05），其中硝酸铵处理下的地上部铵态氮含量分别是硝酸钙和尿素处理的1.19和1.67倍，表明铵态氮和混合态氮更有利于‘Texoka’地上部铵态氮积累。两个品种地下部铵态氮含量均表现为尿素（N1）＞硝酸铵（N4）＞其他氮源，硝酸钙和氯化铵处理无显著差异（P＞0.05），表明尿素和混合态氮对于野牛草根部铵态氮积累的促进作用明显好于单一形态氮（图4）。

图4 氮素形态对野牛草铵态氮含量的影响Fig.4 Effects of different nitrogen forms on ammonnitrogen content of B.dactyloides

2.2.3 氮素形态对野牛草总氮含量的影响‘Sundancer’地上部总氮含量表现为硝酸铵（N4）＞硝酸钙（N2）＞尿素（N1）＞氯化铵（N3），‘Texoka’地上部总氮含量表现为硝酸铵（N4）＞硝酸钙（N2）＞氯化铵（N3）＞尿素（N1），两个品种地下部总氮含量均表现为硝酸铵（N4）＞硝酸钙（N2）＞氯化铵（N3）＞尿素（N1），表明混合态氮源相较于其他氮素类型更有利于野牛草氮素积累（图5）。

图5 氮素形态对野牛草总氮含量的影响Fig.5 Effects of different nitrogen forms on total nitrogen content of B.dactyloides

2.2.4 氮素形态对野牛草氮肥利用效率的影响‘Texoka’的氮肥利用效率在硝酸铵处理下显著高于尿素处理（P＜0.05），达到31.94%，是尿素的1.54倍，硝酸钙的1.38倍，氯化铵的1.35倍，表明混合态氮对提高‘Texoka’的氮肥利用效率有明显的促进作用。‘Sundancer’在不同氮素形态处理下，氮肥利用效率无显著差异（P＞0.05）。‘Texoka’在尿素、硝酸钙和氯化铵处理下氮肥利用效率无显著差异（P＞0.05），且与各种氮素形态处理下‘Sundancer’的氮肥利用效率无显著差异（P＞0.05）。在硝酸铵处理下，‘Texoka’的氮肥利用效率显著高于‘Sundancer’（P＜0.05），是其1.64倍，表明在硝酸铵处理下不同野牛草品种的氮肥利用效率有较大的差异，在其他氮素形态处理下，不同野牛草品种间氮肥利用效率无显著差异（图6）。

图6 氮素形态对野牛草氮肥利用效率的影响Fig.6 Effects of different nitrogen forms on nitrogen use efficiency of B.dactyloides

2.3 氮素形态对野牛草氮同化相关酶活性的影响

2.3.1 氮素形态对野牛草硝酸还原酶（NR）活性的影响 ‘Sundancer’地上部NR活性在氯化铵处理下显著高于其他氮素形态（P＜0.05），硝酸钙处理和硝酸铵处理无显著差异（P＞0.05）。‘Texoka’地上部NR活性在氯化铵处理下显著高于硝酸钙处理（P＜0.05），氯化铵处理、尿素处理和硝酸铵处理无显著差异（P＞0.05），尿素处理、硝酸钙处理和硝酸铵处理无显著差异（P＞0.05）。表明单一施加铵态氮肥，野牛草地上部NR活性有一定提高。‘Sundancer’地下部NR活性在硝酸铵、尿素和硝酸钙处理下无显著差异（P＞0.05），均显著高于氯化铵处理（P＜0.05），‘Texoka’地下部NR活性表现为尿素（N1）＞硝酸铵（N4）＞硝酸钙（N2）＞氯化铵（N3）＞对照（N0）（图7）。

图7 氮素形态对野牛草硝酸还原酶活性的影响Fig.7 Effects of different nitrogen forms on nitrate reductase activity of B.dactyloides

2.3.2 氮素形态对野牛草谷氨酰胺合成酶（GS）活性的影响 ‘Sundancer’地上部GS活性在硝酸铵处理下显著高于其他氮素形态（P＜0.05），硝酸钙和尿素处理无显著差异（P＞0.05），氯化铵处理显著低于其他氮素形态和不施氮处理（P＜0.05）。‘Texoka’地上部GS活性在硝酸钙、硝酸铵和尿素处理下无显著差异（P＞0.05），均显著高于氯化铵处理（P＜0.05）。表明单施铵态氮对野牛草地上部GS活性有显著的抑制作用。‘Sundancer’和‘Texoka’地下部GS活性在不施氮处理下均显著高于尿素、硝酸钙和氯化铵处理（P＜0.05），不施氮和硝酸铵处理无显著差异（P＞0.05），表明野牛草地下部在氮贫瘠环境下会提高GS活性以吸收更多氮素，混合态氮素更有利于提高地下部GS活性。在硝酸铵、硝酸钙、尿素和不施氮处理下，‘Sundancer’地上部GS活性均显著高于‘Texoka’地上部GS活性（P＜0.05），表明地上部GS活性品种间存在较大的差异（图8）。

图8 氮素形态对野牛草谷氨酰胺合成酶活性的影响Fig.8 Effects of different nitrogen forms on glutamine synthetase activity of B.dactyloides

2.3.3 氮素形态对野牛草谷氨酸合酶（GOGAT）活性的影响 ‘Sundancer’和‘Texoka’地上部GOGAT活性在硝酸铵处理下均显著高于其他处理（P＜0.05），硝酸钙、尿素和氯化铵处理间无显著差异（P＞0.05），表明混合态氮对野牛草地上部GOGAT活性有显著的促进作用。‘Sundancer’地下部GOGAT活性在硝酸铵处理下显著高于其他处理（P＜0.05），尿素和氯化铵处理无显著差异（P＞0.05），硝酸钙处理与氯化铵处理无显著差异（P＞0.05），显著低于尿素和硝酸铵处理（P＜0.05）。‘Texoka’地下部GOGAT活性在硝酸铵、尿素和氯化铵处理下无显著差异（P＞0.05），均显著高于硝酸钙处理（P＜0.05），表明单施硝态氮对野牛草地下部GOGAT活性有显著的抑制作用（图9）。

图9 氮素形态对野牛草谷氨酸合酶活性的影响Fig.9 Effects of different nitrogen forms on glutamate synthase activity of B.dactyloides

2.4 氮素形态对野牛草的综合影响

2.4.1 主成分分析 PCA主成分分析结果显示，沿第1轴方向，处理组明显区别于对照组，表明氮素是影响野牛草生长发育的关键因素。硝酸铵、硝酸钙和尿素处理的样点较为集中，95%置信区间部分重叠，表明这3种氮素形态对野牛草的影响差异不显著。硝酸铵和硝酸钙处理的样本点与氯化铵处理的样本点有明显的分离，95%置信区间均不重叠，表明氯化铵处理与硝酸铵和硝酸钙处理对野牛草的影响均有显著差异。综合各指标发现，硝酸铵对野牛草部分性状有抑制作用，硝酸钙和硝酸铵作为氮源更有利于野牛草生长发育（图10）。

图10 不同氮素形态对野牛草影响的主成分分析Fig.10 PCA of effects of different nitrogen forms of B.dactyloides

2.4.2 隶属函数综合分析不同处理隶属函数综合排名为T-硝酸铵＞S-硝酸铵＞T-尿素＞S-硝酸钙＞S-尿素＞T-硝酸钙＞T-氯化铵＞S-氯化铵＞TN0＞S-N0，表明硝酸铵可以显著促进野牛草的生长和生理活性。氯化铵对野牛草的促进作用较差。尿素比硝酸钙更有利于‘Texoka’生长，硝酸钙比尿素更有利于‘Sundancer’生长，表明野牛草对不同氮素形态吸收效率存在一定的品种间差异（表2）。

表2 氮素形态对野牛草影响的隶属函数综合分析Table 2 Comprehensive analysis of membership functions of the effect of nitrogen forms on B.dactyloides

3 讨论

氮是植物生长发育必不可少的营养元素，不同氮素形态对植物生长发育的影响有较大差异。如仅以铵态氮为氮源，玉米（Zea mays）叶片生物量是以硝态氮为氮源的两倍，且促进花青素的积累，但会减少叶绿素和类黄酮的积累；如以硝酸铵为氮源可以显著提高玉米叶片叶绿素含量、百粒重和产量［17-18］。小麦（Triticum aestivum）的研究中发现，增施硝酸盐可以显著提高生物量，增施铵盐会抑制生物量积累，过多的铵离子还会造成“铵毒害”，但以硝酸铵为氮源可以有效降低胞间CO2浓度、提高光合效率和减少游离脯氨酸含量，因此均衡的硝铵比是获得良好品质的关键［19-20］。与大部分植物在不同氮素形态处理下生物量差异较大相比，本研究结果显示，同一品种野牛草的生物量对氮素形态不敏感，在4种氮素形态下均可正常生长，这可能是由于野牛草具有较强的生态适应能力，养分利用策略较为灵活，使其拥有较强的竞争能力，这与Weight等［6］的观点是相符的，为野牛草在更广阔的范围内应用奠定基础。

氮素形态还会影响植物的生长速率和株高，如春小麦在硝铵混合态氮处理下生长速率显著快于单一氮源处理；硝态氮可以显著提高烤烟（Nicotiana tobacum）株高、茎围和节距［21-22］。野牛草在不同氮素形态处理下株高的变化趋势是相同的，最终株高表现为‘Sundancer’在硝酸钙处理下株高最高，‘Texoka’在硝酸铵处理下株高最高，这与前人认为硝态氮和混合态氮更有利于植物生长的观点是相同的。本研究中‘Texoka’的平均株高显著高于‘Sundancer’（P＜0.05），这可能是由于‘Texoka’是野牛草较为古老的一个品种，主要用于牧场生产优质的饲料草，具有较高的鲜草产量，‘Sundancer’是目前新近育成的野牛草品种，主要用于草坪建植，具有植株较低、生物量较小的特性，仅从形态上无法充分体现肥效。

如果外源施入的氮素形态与植物对氮素形态吸收偏好相一致，植物就能更好地吸收和利用氮素［23］。前期关于玉米的研究发现，硝态氮和铵态氮配施对玉米花前期氮素积累、灌浆期氮素由营养器官向籽粒转运有促进作用，提高硝态氮占比有利于提高玉米叶片和茎对籽粒氮素的贡献率［24-25］。本研究发现，单施加硝酸钙时，野牛草地上部硝态氮含量最高；单施氯化铵时，野牛草地上部铵态氮含量最高，表明单一氮源会促进野牛草地上部以与氮源相同的氮素形态积累氮，但会抑制部分氮同化酶的活性。野牛草总氮含量均表现为硝酸铵处理时最高，其次是硝酸钙处理，这说明野牛草对硝态氮有明显吸收偏好。

本研究中，在氯化铵处理下，野牛草地下部NR活性均显著低于其他氮素形态（P＜0.05），这可能是由于NR大量分布在植物根系中，当土壤施加铵态氮肥时，铵作为硝酸盐代谢的中间产物，对NR活性产生反馈抑制［26］。而氯化铵处理下，野牛草地上部谷氨酰胺合成酶（GS）活性均显著低于其他氮素形态（P＜0.05），地下部GS活性显著低于硝酸铵处理（P＜0.05），其原因可能是合理的硝铵比促进GS活性，过量的NH4＋造成“铵毒害”，抑制GS活性，这与孙敏红等［27］关于枳橙（Citrus sinensis×Poncirus trifoliate）的研究结果相似。氮素同化过程中，NR和GS的活性直接关系到谷氨酸合酶（GOGAT）的底物量，在油茶（Camellia oleifera）的研究中［28］，硝铵1∶1处理时植物GOGAT活性最高，本研究中也发现硝酸铵处理下野牛草地上部和地下部GOGAT活性均显著高于其他氮素形态（P＜0.05）。

氮素形态对野牛草两个品种的生长和生理影响各有差异，为了能够客观综合地比较各处理对野牛草生长的作用，本研究采用隶属函数综合分析法，该方法可反映不同处理对野牛草促进作用的大小，隶属度值越高表明促进作用越强。结果显示，各处理隶属度值排名为T-硝酸铵＞S-硝酸铵＞T-尿素＞S-硝酸钙＞S-尿素＞T-硝酸钙＞T-氯化铵＞S-氯化铵＞T-N0＞S-N0。方差分析结果显示，硝酸铵处理对氮素同化相关酶活性、总氮含量有明显的促进作用，氯化铵处理对酶活性和总氮含量的促进作用不明显，而且对GS活性有抑制作用，PCA主成分分析结果也显示氯化铵处理与硝酸铵和硝酸钙处理有显著差异（P＜0.05），这与隶属函数分析结果一致。