■余诗强 熊安然 熊本海 蒋林树*

（1.北京农学院动物科学技术学院，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 102206；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193）

2020 年1 月1 日起，除中药类外的促生长类药物饲料添加剂被禁止添加到动物饲料中，天然植物饲料原料开始被人们广泛关注。天然植物饲料原料中富含多酚、多糖、黄酮和单宁等多种营养活性物质，其具有抗菌、抗炎和抗氧化应激等多种生物学功能，能激活自身免疫系统，提高饲料报酬、减少畜禽污染，并可以促进维持动物氧化应激—炎症反应—免疫三方联动效应的稳定。科学合理地利用天然植物饲料原料活性物质的生物学特性是畜禽减抗、健康、绿色养殖的核心环节。

天然植物饲料原料活性物质成分复杂，其含有的化合物种类多，分子结构复杂，多种活性成分之间具有协同或颉颃作用，发挥主效作用的并不是单一的化学成分。因此对天然植物饲料原料活性物质中主效因子的挖掘与探究是推动天然植物饲料原料活性物质应用于生产实践的重要部分，结合天然植物饲料原料活性物质中变化的化学成分和生物学试验结果，建立两者的“谱效关系学”，反映天然植物饲料原料活性物质内在的质量标准，使其更加科学化和标准化。目前指纹图谱是反映营养活性物质“多组分，多靶点”特点的重要手段，而谱效关系是基于指纹图谱的更深一层次的科学研究，能够反映物质的内在质量，并从整体上对内在化合物协同或颉颃作用进行评价。合理的利用谱效关系能够鉴别天然植物饲料原料活性物质真实性、一致性和稳定性，从而有利于天然植物饲料原料活性物质在实践中的应用，促进其发展，实现天然植物饲料原料活性物质在畜牧上广泛应用。文章介绍了天然植物饲料原料活性物质谱效关系的研究方法和应用概况，以期为研究天然植物饲料原料活性物质中主效因子提供理论依据和研究思路。

1 天然植物饲料原料活性物质谱效关系的方法设计

谱效关系的研究是结合化学成分与活性作用的研究，将“谱”与“效”相结合，从物质整体研究其有效化学成分与作用的关系，通过一定的分析方法将不同品种、来源、批次的样品进行指纹图谱建立和体内或体外活性效果试验，再将每一个指纹峰和每一个样本产生的活性效果分别看成一个变量，采用一定的数据分析方法将指纹峰和活性效果进行关联性分析，建立谱效模型，阐明指纹峰与活性效果之间的关系，从而进一步确立发挥活性作用的主效因子。主要研究思路及内容见图1。

1.1 样品的前处理

目前谱效关系多采用不同产地、批次和收获时间的样品，来源不同的样品其成分和效果存在着一定的差异，通常采用同种方法对样品进行处理，筛选有效部位且最大程度地保留有效成分是样品前处理的最终目的。目前对样品处理普遍使用的方法包括超声提取法、微波法、酶提法和乙醇萃取法等。采用不同的方法对丹参进行提取，发现相对于传统提取方法微波提取的产物成分及含量更多。同样，不同的方法对甘草进行提取分析，发现提取工艺对甘草有效成分的提取有着显著的影响，其中乙醇萃取后的甘草活性成分及含量最多。因此，选择合理的前处理方法是保证谱效关系准确性的基础。

1.2 谱效关系“谱”的建立

谱效关系研究的基础是指纹图谱的建立，最大限度地获取活性物质中有效的化学信息指纹图谱，减少活性成分的遗漏是建立谱效信息的关键；营养活性物质中有效成分复杂、理化性质差异大，一种检测方法或者单一的分析方法不能准确地对其内在的成分进行分析。因此，选择合适的分析方法至关重要。

1.2.1 高效液相色谱法

HPLC 应用于众多领域，并在近些年得到了很大的改进，它具有分离效率高、分析速度快、样品消耗少、定量精密度高、稳定性好、色谱柱可重复使用等优点，广泛用于活性物质的定性定量分析；此外，HPLC可以与不同的检测器偶联，可以满足不同样品的测定，一定程度上扩大了应用范围，但是HPLC 在使用过程中产生的废弃物容易污染环境，并且很难分析大分子化合物。HPLC 在分析黄酮、多酚和多糖等营养活性物质方面应用广泛且效果显著，使用HPLC 对不同产地的桑叶进行质量评价，发现为新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸和芦丁是桑叶中的主要活性成分，且表现出较好的稳定性和重现性。王兵等（2021）建立复方黄芪饲料添加剂的指纹图谱后分析发现，复方黄芪饲料添加剂中主要含黄酮类和类黄酮类化合物，主要含有芒柄花黄素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及左旋紫草素。对于复杂且多组分的天然植物饲料原料活性物质，利用HPLC易于改变分析条件等优势可以实现对复杂组分的快速有效分离，能广泛地应用于谱效关系的研究。

1.2.2 超高效液相色谱法

与传统HPLC 相比，UPLC 通过填充小颗粒的色谱柱（小于2 μm）后能够承受高背压，提高色谱分辨率和灵敏度，显著缩短试验时间，同时也减少了溶剂消耗，使其对环境的负面影响较小，目前UPLC广泛用于检查饲料中非法物质的添加以及某些常规营养物质的检测。采用UPLC-Orbitrap-MS/MS 对不同来源的绿茶进行成分分析，发现没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶精-（4β→8）-表儿茶精-3-O-酸酯和牡荆素为绿茶中的主要标志性化合物，该方法可有效的对活性物质进行表征。相关研究也证明UPLC可作为一种有效地分析方法对饲料中维生素、蛋白质等常规营养活性物质和天然饲料原料中黄酮、多酚和多糖等营养活性物质进行表征代谢分析。

1.2.3 气相色谱法

GC是一种主要用于挥发性化合物表征和鉴定的分析技术，与其他传统的提取分离方法相比，GC具有灵敏度高、分离度好、分析速度快、样品消耗小等优点，但是由于热不稳定化合物在分析的过程中极易挥发分解，使GC 不适用于大多数营养活性物质的分析。目前GC广泛用于挥发性的营养活性物质如植物精油类，佛手属于天然植物饲料原料的一种，其富含精油类营养活性物质，利用GC-MS分析，发现佛手瓜中含有117 种精油成分，主要为萜类、倍半萜类和醇类，其中柠檬烯和γ-松油烯含量最多。利用GC-MS鉴别出姜黄精油提取物中含有11 种化合物，占挥发油的90.29%，其中松油烯（52.88%）和α-水芹烯（21.13%）为主要成分，这些精油在体外试验中发挥出显著的抗炎活性。GC在谱效关系研究中的应用相对狭隘，但对于热稳定化合物的分析效果良好。

1.2.4 色谱与质谱联用法

色谱-质谱联用法是将色谱技术和质谱联合使用，配合适当的接口组合成一个完整的分析系统，理论上能发生电离的化学成分均可被检测出来，其克服了其他方法无法确定有效成分的一些缺点，是目前国内外最成熟的检测分析方法之一。其中UPLC-MC、HPLC-MC、GC-MS是谱效分析中比较常用的方法，同时其与代谢组学联合使用能更好地阐明活性物质发挥生物学功能的主效因子。Peng 等（2020）使用UPLC-ESI-QTOF/MS 和HS-SPME-GC-MS 法鉴别出杭白菊中木犀草素、芹菜素和没食子儿茶素没食子酸酯3种黄酮类化合物和α-萜品醇、麝香草酚和胡椒碱等4 种单帖类化合物为杭白菊发挥强黄嘌呤氧化酶抑制的主效因子，阐明了杭白菊发挥活性的主要物质基础。采用UPLC-MS/MS 法分析枸杞抗氧化活性发现在其发挥抗氧化活性的同时，有6种化合物发挥着主要作用，其中绿原酸、槲皮素、山奈酚和异鼠李素的贡献最大。总之，活性物质中各类成分复杂，单一的检测器或分析方法建立的难以准确地对其中的主效因子进行表征，使用色谱质谱联用法能实现信息的互补及获得更加完善的样品信息，可以对样品进行更准确的分析。

1.2.5 高效液相色谱柱后生物活性在线检测法

高效液相色谱柱后生物活性在线检测法克服了传统分离方法工作量大、分离盲目、成本高的缺点，其基于酶、受体和抗氧化剂等方面对营养活性物质的作用效果进行在线分析，减少了体外试验，对特定标志物具有活性的新靶化合物才需要进一步分离和测试，极大地提高了工作效率。该方法可用于营养活性物质中抗炎抗氧化剂、乙酰胆碱酯酶（AchE）抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂等关键靶标成分的筛选。Wang 等（2020）成功建立了一种用于初步筛选多组分体系黄酮类营养活性成分，实现了体外肠吸收模型、固相萃取和高效液相色谱的在线耦合，利用该方法对黄芩、虎杖中的黄酮类营养活性物质进行筛选得到14种黄酮类营养活性成分，该方法与传统方法相比更加准确，更能全面地从复杂成分中筛选出靶标成分，适用于黄酮类营养活性物质中主效因子的筛选与测定。采用在线HPLC-DPPH/ABTS 和HPLC-PDA-FL 方法对丹参中发挥DPPH/ABTS+清除和AchE 抑制作用的主效因子进行筛选，证明丹参中含量较多的主要峰发挥主要的DPPH/ABTS+氧化自由基的清除作用，而原儿茶醛、丹酚酸H、丹酚酸I和紫草酸等较弱的峰表现出较强的AchE抑制作用。高效液相色谱柱后生物活性在线检测法将单一的研究模式转向“化合物+生物活性”模式，方便了对天然营养活性成分的研究。

1.3 谱效关系“效”的建立

1.3.1 体外试验

体外试验利用离体细胞、器官或者已经公认有效的试剂盒模型研究活性物质在一特定整体中一部分的活性作用，效果显著且直观，精准的体外分析对于在细胞和亚细胞水平上的机制研究具有重要意义。目前广泛采用体外试验对营养活性物质的抗菌、抗炎、抗氧化等活性进行分析，利用DPPH 法、ABST 法和酪氨酸酶激活法对苹果花中抗氧化和酪氨酸酶抑制剂主效因子的研究，证明金丝桃苷、根皮苷和槲皮素是苹果花发挥抗氧化活性的主效因子，根皮苷和金丝桃苷发挥着酪氨酸酶抑制活性，同时发现选用不同的抗氧化分析方法最终得到的结果会略有差异，但大体一致，证明了利用体外试验验证谱效关系的可行性。同样，对枸杞的抗氧化活性的主效因子进行研究，发现DPPH 法和ABTS 法的结果基本一致，其发挥抗氧化活性的主效因子主要为绿原酸、山奈酚、槲皮素和异鼠李素，通过与标准品和其他参考文献比较也验证了它们的强抗氧化活性。总之，体外试验能有效地控制试验条件，重复性良好，耗材少且试验结果易于分析，但相对于体内试验缺少一定的真实性。

1.3.2 体内试验

体内试验一般采用正常或者人为设定的特定生理条件的动物模型，按照试验需要对动物进行处理和分组后进行饲养，之后观察目标活性效果，记录数据，其可以在动物麻醉或者清醒时进行试验，这种方法极大地保持了机体的完整性，使机体与外界保持联系，接近实际的作用效果，结果更为可靠。该方法一般使用小动物当作试验载体，如利用鹌鹑研究菊苣降尿酸的效果，发现菊苣中的秦皮甲素、绿原酸、菊苣酸、异绿原酸和14（15）-二烯-3α-醇在降尿酸上发挥着重要作用，同时也为研究活性物质降尿酸的主效因子的研究提供了一个通用模型。缪艳燕等（2020）以炎症小鼠为试验模型探究金银花抗炎作用的谱效关系，发现芦丁、金丝桃苷、异绿原酸B、木犀草素、绿原酸、马钱苷、新绿原酸、异绿原酸C 和异绿原酸A 是金银花发挥抗炎作用的主效因子。体内试验在一定程度上提高了谱效关系的可信性，其适用于神经反射、免疫调节及内部器官功能等研究，符合实际条件，为研究营养活性物质中的主效因子提供了方法。

2 谱效关系的分析方法

指纹图谱中的峰与活性效果数据之间的相关性需要相应的数据分析方法进行处理和分析。目前科学研究中还没有一个统一的模型可以完全科学地将“谱”与“效”相结合。但在目前的研究中，已有许多合理的数据分析方法被大家所认可，并证明其在谱效关系的研究中可靠性和真实性较高。

2.1 典型相关性分析（CCA）

CCA 常用于分析和量化两个多维变量之间的线性关系。该方法以营养活性物质的色谱指纹图谱和活性效果为变量，分析两者之间的相关性。在用来评价相关程度的相关系数中，Pearson 的相关系数在目前最常用，它不仅显示两个变量之间的相关强度，还提供了两者之间的正负相关性，但CCA 在分析过程中只考虑了指纹图谱与活性效果之间的关系，忽略了其他相关变量的影响。Zheng 等（2014）利用CCA 对附子及其三种加工产物与肝脏线粒体新陈代谢的谱效关系进行了研究，确定了指纹图谱中有26 个峰与肝脏线粒体代谢成典型相关，鉴定了新乌头碱、苯甲酰乌头碱和苯甲酰次乌头碱为影响线粒体代谢的主效因子，其为附子产品的开发利用提供了理论参考。

2.2 主成分分析（PCA）

PCA 是一种用于分析和简化数据集的方法。它能够降低数据集的维数，保持对数据集方差的最大贡献，突出数据的异同点，在谱效关系的研究中，每个色谱峰的面积被量化为数据并标准化，之后再对经过标准化处理的数据矩阵进行PCA 分析。利用DPPH 法结合PCA 对不同产地蜂胶样品不同成分抗氧化活性进行分析，结果表明蜂胶中异芥酸、咖啡酸、海角、3,4-二甲氧基肉桂酸、白杨素和芹菜素的含量与蜂胶的抗氧化性能密切相关，利用该方法可为蜂胶的质量的评价提供一定的理论依据。

2.3 聚类分析（CA）

CA 又称群体分析，是基于相似的基础上收集数据来分类的基本原理，通过多元统计分析将样本的数据划分为多个分段，简化了数据的复杂性。CA 主要有层次聚类分析（HCA）、动态聚类方法和模糊聚类方法。在这些聚类分析方法中，HCA 是最常用的CA 方法，可用于初步评价活性物质的谱效关系，但它不能对“谱”和“效”之间的关系提供准确的定量分析。Fan 等（2020）对当归抗氧化谱效关系进行研究时，利用HCA 将不同来源的当归分为了三大类，同时结合PCA 进行分析，发现阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯、3-正丁基苯酚内酯、绿原酸、阿魏酸松柏酯和洋川芎内酯A 是当归发挥抗氧化活性的主效因子。

2.4 偏最小二乘回归分析（PLS）

PLS 已成为数据集探索性分析中谱效关系研究的主要方法。PLS 简化了数据结构和两组变量之间的相关性分析，其能充分利用数据信息，其根据variable importance in projection（VIP值）反映每个自变量对因变量的相关程度，当VIP值大于1.0时，变量之间存在显著的联系，进而将不同峰值对功效的贡献可以用VIP的价值来清晰地反映出来。利用PLS研究枳壳挥发油的抑菌活性，发现α-萜品醇、D-柠檬烯、γ-萜品烯、4-蒈烯、大根香叶烯D、棕榈酸甲酯为枳壳挥发油发挥抑菌作用的潜在主效因子。利用此法对知母的不同提取物进行抗氧化活性谱效关系研究，发现知母中的芒果苷、知母皂苷BⅡ是发挥活性的主效因子。

2.5 灰色关联分析（GRDA）

GRDA 是灰色系统理论的一部分，是由邓聚龙教授首创的一种系统科学理论（Grey Theory），GRDA是根据各因素曲线的几何相似度来确定各因素之间的相关性，需要对原始数据进行处理后再计算相关系数。是一种简单而有效的谱效关系综合评价方法。利用灰色关联对肉豆蔻中的抗炎主效因子进行分析发现，在发挥抗炎活性的过程中有5 个峰与抗炎活性关联性极强，但未鉴定为何种物质。邢冬梅等（2020）将GRDA 与PLS 相结合，初步确定了当归挥发油中的Z-藁本内酯、6-丁基-1,4-环庚二烯、丁烯基苯酞和α-蒎烯等物质为发挥抗氧化活性的主效因子。目前GRDA 在谱效关系的研究中已被广泛使用。

2.6 神经网络分析（ANN）

ANN是通过模仿动物神经网络行为特征，对复杂数据进行分布式并行信息处理的算法数学模型，能够从未知大量的复杂数据中发现一定的规律，其避免了传统分析方法的复杂性，通过分析选择适当的模型函数对数据进行分析，利用非线性拟合功能探究事物间模糊性规律，简化了建模过程，提高了数据处理效率。杨中林等（2005）采用PCA结合ANN的方法对厚朴指纹图谱与厚朴清除活性氧能力的关系进行分析，其构建了一种效果稳定、运算速度快和准确性高的的网络模型，为厚朴抗氧化活性的谱效关系研究提供了一种新的方法。此外，采用体外DPPH 法和Fe2+络合法探究枸杞蜜的抗氧化活性谱效关系，利用GRDA、GRDA 结合ANN 对谱效关系进行分析，发现其抗氧化能力与枸杞蜜中的总多酚和总黄酮含量呈显著剂量-效应关系，并分析出2，3-二羟基苯甲酸、山奈酚、柚皮素和p-香豆酸是枸杞蜜的抗氧化活性的主效因子。

3 主效因子的化学结构鉴定

在谱效关系研究中，通常以标准品对照、文献资料查询比较和色谱分析等方法对谱效分析得到的主效峰进行化学结构鉴定。目前色谱技术被广泛应用于主效峰化学成分的分离和鉴定，其中制备型高效液相色谱（PHPLC）和HSCCC 以分离能力强、检测方便、回收率高的优势成为谱效关系研究的重要方法。PHPLC 是一种利用高压、大流量的液体输送系统在高分辨率、大内径、大容量的分离柱上对样品进行高纯度分离的方法，该方法在纯度、回收率和分离效率等方面均优于传统方法，利用PHPLC 将地瓜提取物中的绿原酸可提取纯化到9.86%，为在植物中提取绿原酸提供了新的技术支持，也反映了其在谱效关系研究中的高效性和实用性。HSCCC 是逆流色谱的一种形式，它是基于化合物在两个不相混的液相之间的分配而没有载体基质，可以消除固体载体中的不可逆吸附，利用UPLC-MS/MS-HSCCC 对苹果花抗氧化和酪氨酸酶活性成分进行分析，鉴定出金丝桃苷、阿夫泽林、山奈酚和槲皮素为抗氧化活性的主效因子，根皮苷、金丝桃苷和阿夫泽林为发挥酪氨酸酶抑制作用的主效因子。它们作为一种无载体的液-液分配色谱技术，已广泛应用于天然产物的制备分离。

4 天然植物饲料原料活性物质谱效关系的研究概况

2019 年国家发布了《天然植物饲料原料通用要求》，将杜仲、姜黄等117种天然植物被列入我国饲料原料目录。近年来，广大学者在天然植物谱效关系研究过程中，以不同产地、品种和提取方式得到的样本作为研究对象，研究其指纹图谱与其活性关系的谱效关系，为天然植物饲料原料活性物质谱效关系的研究奠定了基础（见表1）。

表1 天然植物饲料原料中活性物质的谱效关系研究

5 展望

通过选用合适的方法对天然植物饲料原料活性物质进行谱效关系的研究，揭示了天然饲料原料中营养活性物质发挥活性作用的物质基础，实现了化学成分与活性效果的直观反映，是研究天然植物饲料原料活性物质内在品质和发挥作用机制的一种新的研究方法。随着对天然植物饲料原料中营养活性物质研究的不断深入，准确、全面地对其发挥作用的主效因子和作用机制进行研究将促进畜牧业的精准、健康养殖，实现畜牧业的可持续健康发展。