秦玉春，邝向东，蔡林再，谢景臣

作者单位：海南西部中心医院呼吸与危重症医学科，海南 儋州 571700

慢性阻塞性肺疾病（COPD）属于常见的肺部疾病，其发病机制主要是气道炎症、气流受限，而有害气体、吸烟、扬尘以及病原微生物等成为造成COPD的主要原因［1］。该疾病的发病率呈现逐年增长的趋势，已成为全球第三大死亡的主要原因，给病人及家庭造成严重的经济负担［2］。研究报道，西药对于COPD的治疗虽然具有一定的作用，但其副作用严重限制了该类药物的广泛使用，因此副作用小，药效稳定的中草药逐渐成为治疗COPD的研究热点［3］。水蛭素是蚂蟥的主要活性成分，是目前发现的最高效的天然凝血酶抑制剂，临床上被广泛应用于治疗冠心病、肝硬化以及脑血栓等疾病，研究表明水蛭素还具有凝血、抗炎、抗纤维化等作用，但对于COPD的治疗目前鲜有报道［4］。RhoA/Rho激酶（Rho kinase，ROCK）信号通路是重要的信号转导系统，在细胞迁移、发育、生长、分化等过程中发挥重要作用，也是神经突生长、骨形成、背侧闭合和肌生成所必需的，该途径的失调与不同类型的疾病有关，包括与肺部相关的疾病［5］。于2020年1—6月，本研究通过气管内滴注脂多糖（LPS）溶液建立COPD模型，经水蛭素干预后，探索水蛭素对COPD大鼠炎症反应和纤维化以及RhoA/ROCK信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 北京维通利华实验动物技术有限公司提供52只8周龄、雄性、清洁级SD大鼠，体质量范围220~250 g，动物生产许可证号为SCXK（京）2016-0011，动物质量合格证号为1100111911008834。所有大鼠分笼饲养于温度范围22~25℃、湿度范围50%~60%、12 h光照/黑暗循环的饲养房中，常规喂养一周后开始实验。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.1.2 实验试剂与仪器 水蛭素（BTN130542，20 000 ATU/mL）购自北京百奥莱博科技有限公司；HE染色试剂盒（MM1013）购自上海懋康生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）测试盒（EKR38696）购自北京博沃尔斯生物科技有限公司；Masson三色胶原试剂盒（CSX10001）购自上海莼试生物科技有限公司；白细胞介素-1β（IL-1β）（H002）购自南京建成生物工程研究所；RhoA一抗（ab187027）、Rho激酶1（ROCK1）一抗（ab134181）购自abcam公司；ROCK激活剂［溶血磷脂酸（LPA）］（L7260，1 mg）购自Sigma公司。

MK3酶标仪购自芬兰雷勃公司；IX71荧光显微镜购自日本Olympus公司；动物肺功能分析仪购自北京拜安吉科技有限公司；Optima MAX-TL台式超速离心机购自贝克曼库尔特国际贸易（上海）有限公司；600D型通用型电泳仪电源购自北京鸿涛基业科技发展有限公司。

1.2 COPD大鼠模型的制备、分组及给药参照文献［6］复制COPD大鼠模型：将适应性喂养一周的52只大鼠，按照随机数字表法选取10只作为对照组，剩余42只大鼠作为造模组，在实验第1、15天时，对造模组大鼠采用50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，于大鼠颈部中央消毒并切开切口，分离气管，采用头皮针穿刺气管，然后向气管内注入浓度为1 g/L LPS溶液（2 mg/kg）；注入结束后，为使药物充分流入肺内，可将大鼠立起旋转2 min，之后缝合伤口，上述操作均在无菌条件下完成。当大鼠0.3秒用力呼气容积（FEV0.3）与用力肺活量（FVC）比值（FEV0.3/FVC）<70%时，表明大鼠模型建立成功［7］。造模过程中大鼠死亡2只，将造模组剩余40只大鼠按照随机数字表法分为模型组、水蛭素组、LPA组、水蛭素+LPA组，10只/组。水蛭素组分别给予50 U/kg水蛭素灌胃 干预［8］，LPA组给 予 腹腔 注射40μg/kg LPA干预［9］；水蛭素+LPA组分别给予50 U/kg水蛭素、40 μg/kg LPA干预；其余各组给予生理盐水干预，干预1次/天，连续干预4周。

1.3 观察指标

1.3.1 肺功能检测 次日，戊巴比妥钠麻醉大鼠，固定大鼠并对其颈部消毒，分离气管，将气管插管与肺功能分析仪连接，分别记录FEV0.3、呼气峰值流速（PEF）、FVC。

1.3.2 炎性因子指标的检测 肺功能指标检测完成后，麻醉大鼠，经颈部总动脉取血0.6 mL，4 000 r/min离心10 min，取上清，按照Elisa试剂盒说明书检测TNF-α、IL-1β水平。

1.3.3 观察肺组织形态学及肺纤维化变化 取适量肺组织，脱水、透明并用石蜡包埋，制作切片，行HE、Masson染色，脱水、封片，观察各组大鼠病理状况及肺纤维化。

1.3.4 检测大鼠肺组织中RhoA/ROCK通路蛋白表达 取适量肺组织，加入裂解液提取蛋白质，离心取上清，BCA试剂盒测定总蛋白浓度，取适量蛋白上样，电泳分离，转膜，封闭；分别加入稀释后（1∶1 000）的RhoA一抗、ROCK1一抗，4℃过夜孵育；洗膜后，加入二抗（1∶2 000）37℃孵育，ECL显色曝光，以β-actin为内参，利用Image J图像分析软件分析条带图，得出目的蛋白的相对表达水平。

1.4 统计学方法本研究所得数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，均符合正态分布，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水蛭素对各组大鼠肺功能指标的影响与对照组相比，模型组大鼠FEV0.3、FVC、PEF均显著降低（P<0.05）；与模型组相比，水蛭素组大鼠FEV0.3、FVC、PEF均 显著增加（P<0.05），LPA组 大 鼠FEV0.3、FVC、PEF均显著降低（P<0.05）；与LPA组相比，水蛭素+LPA组大鼠PEF、FEV0.3、FVC均显著增加（P<0.05）；与水蛭素组相比，水蛭素+LPA组大鼠PEF、FEV0.3、FVC均显著降低（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肺功能指标的比较/±s

表1 各组大鼠肺功能指标的比较/±s

注：FVC为用力肺活量，PEF为呼气峰值流速，FEV0.3为0.3秒用力呼气容积。①与对照组相比，P<0.05。②与模型组相比，P<0.05。③与水蛭素组相比，P<0.05。④与LPA组相比，P<0.05。

组别对照组模型组水蛭素组LPA组水蛭素+LPA组F值P值鼠数10 10 10 10 10 FVC/（V/mL）11.21±1.12 7.41±0.71①10.98±0.99②5.34±0.53②8.83±0.85③④81.69<0.001 PEF/（mL/s）31.68±3.24 22.42±2.21①30.54±3.05②16.15±1.62②26.43±2.63③④58.93<0.001 FEV0.3/（V/mL）8.56±0.85 4.61±0.46①8.21±0.82②3.41±0.35②6.25±0.62③④117.84<0.001 FEV0.3/FVC/%76.12±0.76 62.11±0.59①74.77±0.75②63.85±0.61②70.78±0.71③④844.65<0.001

2.2 水蛭素对各组大鼠肺组织病理学变化的影响 对照组大鼠肺细胞形态正常，结构正常；模型组与对照组相比，大鼠细胞出现炎性浸润，上皮细胞出现脱落，管壁增厚；与模型组相比，水蛭素组大鼠病理组织得到改善，炎性浸润减少，细胞脱落、管壁增厚程度逐渐改善，LPA组大鼠炎性浸润、细胞脱落以及管壁增厚程度均明显增加；与LPA组相比，水蛭素+LPA组大鼠病理程度均得到缓解；与水蛭素组相比，水蛭素+LPA组大鼠炎性浸润、细胞脱落等均增加。见图1。

图1 水蛭素对各组大鼠肺组织病理学的影响（苏木精-伊红染色×200）

2.3 水蛭素对各组大鼠肺纤维化的影响模型组大量细胞被染成蓝色，极少量细胞质呈现红色；与模型组相比，水蛭素组大量细胞质被染成红色，着蓝色细胞明显减少，LPA组肺纤维化程度明显加深；与LPA组相比，水蛭素+LPA组细胞着蓝色明显减少，红色细胞质逐渐加深；与水蛭素组相比，水蛭素+LPA组细胞着蓝色逐渐增加，红色细胞质逐渐变浅。见图2。

图2 水蛭素对各组大鼠肺纤维化的影响（Masson染色×200）

2.4 水蛭素对各组大鼠炎性因子水平的影响模型组大鼠TNF-α、IL-1β水平较对照组均显著增加（P<0.05）；与模型组相比，水蛭素组大鼠TNF-α、IL-1β水平均显著降低（P<0.05），LPA组大鼠TNF-α、IL-1β水平均显著增加（P<0.05）；与LPA组相比，水蛭素+LPA组大鼠TNF-α、IL-1β水平均显著降低（P<0.05）；与水蛭素组相比，水蛭素+LPA组大鼠TNFα、IL-1β水平均显著增加（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠炎性因子指标的比较/（ng/L±s）

表2 各组大鼠炎性因子指标的比较/（ng/L±s）

注：TNF-α为肿瘤坏死因子-α，IL-1β为白细胞介素-1β。①与对照组相比，P<0.05。②与模型组相比，P<0.05。③与水蛭素组相比，P<0.05。④与LPA组相比，P<0.05。

组别对照组模型组水蛭素组LPA组水蛭素+LPA组F值P值鼠数10 10 10 10 10 TNF-α 100.32±10.02 545.37±54.56①115.35±11.55②768.39±76.93②265.73±27.11③④427.46<0.001 IL-1β 65.78±6.66 158.63±15.89①68.72±6.88②278.63±27.91②100.48±10.05③④322.29<0.001

2.5 水蛭素对各组大鼠RhoA/ROCK通路蛋白表达的影响模型组大鼠RhoA、ROCK1蛋白表达较对照组均显著增加（P<0.05）；与模型组相比，水蛭素组大鼠RhoA、ROCK1蛋白表达均显著降低（P<0.05），LPA组大鼠RhoA、ROCK1蛋白表达均显著增加（P<0.05）；与LPA组相比，水蛭素+LPA组大鼠RhoA、ROCK1蛋白表达均显著降低（P<0.05）；与水蛭素组相比，水蛭素+LPA组大鼠RhoA、ROCK1蛋白表达均显著增加（P<0.05）。见图3，表3。

图3 各组大鼠肺组织RhoA、ROCK1蛋白质印迹法图

表3 各组大鼠RhoA、ROCK1蛋白表达的比较/±s

表3 各组大鼠RhoA、ROCK1蛋白表达的比较/±s

注：RhoA为蛋白RhoA，ROCK1为Rho激酶1，β-actin为β-肌动蛋白。①与对照组相比，P<0.05。②与模型组相比，P<0.05。③与水蛭素组相比，P<0.05。④与LPA组相比，P<0.05。

组别对照组模型组水蛭素组LPA组水蛭素+LPA组F值P值鼠数10 10 10 10 10 RhoA/β-actin 0.22±0.02 0.78±0.07①0.27±0.03②1.02±0.11②0.58±0.06③④262.05<0.001 ROCK1/β-actin 0.25±0.02 0.74±0.07①0.29±0.03②0.98±0.09②0.57±0.06③④263.77<0.001

3 讨论

COPD疾病已经影响全球十分之一的人口，被世界卫生组织确定为全球未被满足的主要健康需求，且数据显示，到2030年COPD将成为全球第三大致命疾病，预计将影响越来越多的全球人口［10-11］。COPD是一种使人衰弱但可预防的多因素疾病，其特征是无法治愈的进行性气流受限，临床表现多种多样，包括肺气肿、慢性支气管炎以及病人的呼吸道症状急性恶化，给医疗系统和社会均带来巨大的经济负担［12］。本研究通过气管内滴注LPS溶液建立COPD模型，当FEV0.3/FVC<70%时，表明大鼠模型建立，可进一步研究。

COPD的发病机理较为复杂，而异常的炎症反应被认为参与了COPD病情发展，因此炎性因子如TNF-α、IL-1β在COPD气道炎症反应中发挥关键作用［13］。水蛭素是一种从中药水蛭中提取的分泌多肽，被认为是最有效的天然凝血酶抑制剂，含有抗癌、抗凝血、抑菌和降血脂等多种药理活性，与许多疾病的病理过程有关［14］。Shen等［15］研究发现人锰超氧化物歧化酶与水蛭素的融合蛋白可以降低肺部炎症，阻止肺纤维化的发展。水蛭素可抑制博莱霉素致特发性肺间质纤维化大鼠的肺组织炎症和纤维化，且呈现剂量依赖性［16］。本研究发现模型组大鼠肺组织损伤及纤维化较严重，PEF、FEV0.3、FVC较对照组显著降低，而IL-1β、TNF-α水平均显著增加；经水蛭素干预后，大鼠肺组织损伤及纤维化程度得到改善，PEF、FEV0.3、FVC较模型组显著增加，而IL-1β、TNF-α水平均显著降低，表明水蛭素可以抑制COPD大鼠的炎症反应和肺纤维化，改善肺损伤。

RhoA/ROCK信号通路参与多种器官纤维化、心脑血管以及肿瘤浸润等疾病的发生。研究表明通过LPS构建的肺损伤模型中可导致大量炎症细胞的产生，而LPS可激活RhoA/ROCK信号通路参与肺损伤的发展过程［17］。贾海燕等［18］研究发现乌司他丁可以通过抑制RhoA/ROCK信号通路，降低脓毒症小鼠的肺水肿，改善血管通透性和肺损伤。陈勇等［19］研究发现抑制RhoA/ROCK信号通路可以降低炎症反应，减轻病人机械通气时的肺损伤。本实验研究发现模型组大鼠RhoA、ROCK1蛋白表达均显著增加；经水蛭素干预后，大鼠肺组织中RhoA、ROCK1蛋白表达均显著降低。表明水蛭素可以抑制RhoA、ROCK1蛋白表达，改善COPD大鼠肺损伤状况。为进一步验证该猜想，实验引入ROCK的激活剂-LPA，结果发现LPA组大鼠较模型组大鼠肺组织损伤及纤维化程度进一步加重，PEF、FEV0.3、FVC较模型组显著降低，而IL-1β、TNF-α、RhoA、ROCK1蛋白表达均显著增加；与水蛭素+LPA组相比，水蛭素组大鼠肺组织损伤及纤维化程度得到改善，PEF、FEV0.3、FVC较模型组显著增加，而IL-1β、TNF-α、RhoA、ROCK1蛋白表达均显著降低。揭示了水蛭素可以抑制COPD大鼠的炎症反应和肺纤维化，改善肺损伤，可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。

综上所述，水蛭素可以通过抑制RhoA/ROCK信号通路，抑制COPD大鼠的炎症反应和肺纤维化，阻止COPD疾病的进一步发展，为临床治疗COPD疾病提供新的研究方向。