罗光会　杜丽英　王秀珠　张琳　孙一圣　肖卫平　韩伟　罗丛宝　田丽娜

【摘 要】目的：研究膝骨關节炎患者康复程度与关节液成分变化之间的关系，寻找特异性及敏感性高的生化标志物，为准确诊断早期膝骨关节炎提供新的方法，探寻康复程度与关节液微环境变化的关系。方法：选择膝骨关节炎患者120例，对所有患者进行膝关节镜检查，按照Outerbridge分级标准将患者分为4组，Ⅰ度到Ⅳ度，每组30例。再将每组分成3组，分别进行自体富血小板血浆（PRP）+ 干细胞，自体PRP，以及臭氧灌注 + 透明质酸钠（HA）治疗。治疗前和治疗后8个月收集膝骨关节炎患者关节液标本各120份。标本均采用ELISA双抗夹心法对关节液中的印度刺猬蛋白、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）及基质金属蛋白酶-13（MMP-13）含量进行测定。比较治疗前后印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13在关节液中的表达差异，以Spearman等级相关分析Outerbridge分级与关节液组分的关系。采用Shahariarre评分标准评价疗效。结果：印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13表达水平与Outerbridge分级之间均呈正相关（r = 0.790、r = 0.476、r = 0.684，P < 0.01）；预后良好组与预后不良组印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13表达水平比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；根据Outerbridge分级标准，Ⅰ度患者自体PRP + 干细胞治疗优良率与自体PRP组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；Ⅱ～Ⅳ度患者自体PRP +

干细胞组治疗优良率明显高于自体PRP组，差异有统计学意义（P < 0.05）；Ⅰ～Ⅳ度患者自体PRP + 干细胞组治疗优良率均高于臭氧灌注 + HA组，差异有统计学意义（P < 0.05）；Ⅱ度患者自体PRP组治疗优良率与臭氧灌注 + HA组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），在Ⅰ度以及Ⅲ～Ⅳ度的患者中

2组之间比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论：自体PRP联合间充质干细胞治疗膝骨关节炎较常规HA + 臭氧灌注治疗效果显著，且膝骨关节炎患者的康复程度与关节液中印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13

的表达水平相关，说明膝骨关节炎患者的软骨损伤作用机制与印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13的表达水平相关。

【关键词】 膝骨关节炎；印度刺猬蛋白；尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂；基质金属蛋白酶-13；关节液组分；康复

Study on the Application of Component Analysis of Joint Fluid in the Rehabilitation of Knee Osteoarthritis

LUO Guang-hui，DU Li-ying，WANG Xiu-zhu，ZHANG Lin，SUN Yi-sheng，XIAO Wei-ping，HAN Wei，

LUO Cong-bao，TIAN Li-na

【ABSTRACT】Objective：To study the relationship between the degree of rehabilitation of knee osteoarthritis and changes in the composition of joint fluid，to find biochemical markers with high specificity and sensitivity，to provide a new method for accurate diagnosis of early knee osteoarthritis，and to explore the relationship between the degree of rehabilitation and changes in the microenvironment of joint fluid.Methods：One hundred and twenty patients with knee osteoarthritis were selected.All patients were examined by knee arthroscopy.According to the Outerbridge grading standard，the patients were divided into four groups from grade Ⅰ to Ⅳ，with 30 patients in each group.Then，each group was divided into three groups，which were treated with PRP plus stem cells，autologous PRP，and ozone perfusion plus HA.One hundred and twenty samples of knee osteoarthritis were collected before treatment and 8 months after treatment.The contents of Indian hedgehog protein，uPA and MMP-13 in joint fluid were determined by ELISA double antibody sandwich method.The expressions of Indian hedgehog protein，uPA and MMP-13 in joint fluid were compared before and after operation，and the relationship between Outerbridge grade and joint fluid components was analyzed by Spearman rank correlation.The therapeutic effect was evaluated by the Shahariarre scoring standard.Results：The expression levels of Indian hedgehog protein，uPA and MMP-13 were positively correlated with Outerbridge grading（r = 0.790，r = 0.476，r = 0.684，P < 0.01）.The expression levels of Indian hedgehog protein，uPA and MMP-13 in the good prognosis group were significantly different from those in the poor prognosis group（P < 0.01）.According to the Outerbridge grading standard，the therapeutic excellent rate of autologous PRP plus stem cells in patients with grade I was not significantly different from that in the autologous PRP group（P > 0.05）.The therapeutic excellent rate of autologous PRP plus stem cell group was significantly higher than that of autologous PRP group in patients with grade Ⅱ～Ⅳ（P < 0.05）.The therapeutic excellent rate of theⅠ～Ⅳ degree autologous PRP plus stem cell group was higher than that of the ozone perfusion plus HA group，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.The therapeutic excellent rate of autologous PRP treatment group in patients with grade Ⅱ was not statistically significant compared with that of the ozone perfusion plus HA group（P > 0.05），but there was statistically significant difference between the two groups in patients with grade Ⅰ andⅢ～Ⅳ（P < 0.05）.Conclusion：The effect of autologous PRP combined with mesenchymal stem cells in the treatment of knee osteoarthritis is more significant than that of conventional HA plus ozone perfusion，and the degree of rehabilitation of knee osteoarthritis patients is related to the expression levels of Indian hedgehog protein，uPA and MMP-13 in joint fluid.The difference is significant，which indicates that the mechanism of cartilage damage in knee osteoarthritis patients is related to the expression levels of Indian hedgehog protein，uPA and MMP-13.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Indian hedgehog protein;uPA;MMP-13;joint fluid components;recovery

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）以膝关节软骨变性、破坏、骨质增生和软组织退化为特性，临床常见症状有关节疼痛、肿胀、关节积液和骨性肥大等，严重者可出现功能障碍甚至畸形。据有关资料统计，我国40岁人群的患病率为10%～17%，65岁以上50%的人群出现放射学改变，75岁以上人群中发病率约为80%。

KOA的发病原因和机制尚未完全明确，一般认为与炎症、创伤、肥胖、衰老、遗传、代谢障碍等有一定的关系［1-3］。临床中，主要依靠病史询问、体格检查、影像学和相关血液学检查等进行诊断。即便如此，早期准确诊断KOA的方法并未确立，使得很多患者错过宝贵的早期治疗机会。近年来，随着科学技术的发展和检测手段的多样化，关节液组分分析为早期准确诊断关节疾病提供了可能。关节液组分的相关检查是直观反映关节内微环境变化的有效方法，其结果与关节疾病的性质及病变程度密切相关。因此，深入研究关节液中的相关生物标志物并应用于KOA的早期准确诊断及开展相应的治疗具有广阔的前景。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2017年10月至2018年12月

在山东省泰山医院就诊的KOA患者120例，对所有受试者行膝关节镜检查，按Outerbridge分级标准将患者随机分为Ⅰ度组、Ⅱ度组、Ⅲ度组、Ⅳ度组，每组30例。再将每组分成3组，分别进行自体富血小板血浆（PRP）+ 干细胞、自体PRP、臭氧灌注 + 透明质酸钠（HA）治疗。同时，选择30例膝关节正常者，抽取关节液作为对照组。本次研究经山东省泰山医院伦理委员会批准并备案。

1.2 诊断标准 根据中华医学会骨科学分会发布的《骨关节炎诊治指南（2007版）》诊断标准［4］。

1.3 纳入标准 ①符合上述诊断标准；②年龄40～80岁，性别不限；③疼痛持续超过半年；

④目标侧膝关节Outerbridge分级为Ⅰ～Ⅳ级，另一侧低于Ⅱ级；⑤受试者身体一般状况良好，能够自主行走；⑥能够理解并自愿签署知情同意书，能自愿完成试验程序和随访检查。

1.4 排除标准 ①既往关节腔内进行过药物注射（如类固醇激素、玻璃酸钠等）者；②關节液标本被血液污染者。

2 方 法

2.1 治疗方法 自体PRP +干细胞治疗组：抽取患者40～60 mL外周血，分离得到PRP，与间充质干细胞混合后，注射到患侧膝关节腔。自体PRP治疗组：抽取患者40～60 mL外周血，分离得到PRP，注射到患侧膝关节腔。臭氧灌注 + HA治疗组：患侧膝关节腔注射HA，同时注射医用臭氧。

2.2 样本采集 使用美国史密斯公司生产的膝关节镜系统，所有病例治疗前后均行膝关节镜检查，并进行Outerbridge分级。治疗前、治疗后8个月，由同一位医生在早晨8：00对患者进行膝关节穿刺，收集关节液，严格按照无菌操作原则，收集样本后立刻送检。

2.3 样本检测 治疗前后对所有患者穿刺膝关节抽取关节液10 mL，离心机以3000 r·min-1离心15 min，离心半径10 cm，取上清液，并采用美国R&D System公司生产的ELISA试剂盒对关节液中的印度刺猬蛋白、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）及基质金属蛋白酶-13（MMP-13）进行含量测定。试验的主要仪器设备为美国Hyperion M RⅢ型酶标仪。

2.4 观察指标 采用Shahariarre评分标准作为评价指标。优：疼痛完全消失，肿胀消退，关节功能正常。良：疼痛和肿胀明显减轻，无压痛，关节功能基本正常。差：疼痛和肿胀及关节功能无改善或更差。根据Shahariarre评分标准将患者分为预后良好组和预后不良组。预后良好组为评分优、良的患者，预后不良组为评分差的患者。

2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。采用t检验、方差分析，以Spearman等级相关性分析Outerbridge分级与关节液组分的关系。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 不同分级患者治疗前关节液中的印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13表达水平比较 不同病变程度的患者，关节液中的印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13

含量随着病情加重增高，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表1。

3.2 不同方法治疗后患者优良率比较 根据Outerbridge分级标准，Ⅰ度患者自体PRP +干细胞治疗优良率与自体PRP组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；Ⅱ～Ⅳ度患者中自体PRP +干细胞组治疗效果明显高于自体PRP组，差异有统计学意义（P < 0.05）。Ⅰ～Ⅳ度自体PRP +干细胞组治疗优良率均高于臭氧灌注 + HA组，差异有统计学意义（P < 0.05）。自体PRP治疗组在Ⅱ度患者中治疗优良率与臭氧灌注+ HA组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；在Ⅰ度以及Ⅲ～Ⅳ度患者中，2组之间比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3.3 不同预后患者印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13水平比较 预后良好组印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13的含量明显低于预后不良组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

3.4 印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13与病变程度的Spearman相关性分析 KOA患者的印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13水平经等级相关分析，与患者的病变程度均呈正相关（r = 0.790、r = 0.476、r = 0.684，P < 0.01）。

4 討 论

KOA患者会因为疼痛因素的影响而减少自身的活动量，所以容易造成周围肌肉萎缩、关节失稳、韧带松弛，以及关节应力不均等症状，一旦改变正常负荷传导，则会很容易加重对关节结构的破坏。

关节液中细胞因子种类繁多，成分复杂，是一组具有可调性的调节蛋白质，可以传达细胞间的信号，在免疫应答和炎症反应中起着重要的作用，如细胞间的信息传导、生长和分化。细胞因子被认为在KOA的发病中扮演着重要的角色。研究发现，细胞因子能够促使软骨细胞分泌促炎相关因子，最初由滑膜产生，然后透过关节液弥散到软骨表面。临床上，白细胞介素（IL）-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-18、TNF-α符合用于诊断的分类，可用于辅助OA的早期诊断［5-7］。另外，关节液中的蛋白酶如MMP-l、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9能够直接反映软骨的破坏情况，也与骨关节炎的早期诊断密切相关［8-9］。使用新的研究技术检测关节液相关标志物，如研究者利用关节炎动物模型，进行磁捕获关节标志物研究，发现Ⅱ型胶原C-肽端、葡糖氨基聚糖、软骨寡基质蛋白可以捕获［10-11］。此外，外源性和内源性晶体物质可以在关节液中检测到，如在诊断KOA中最常用的水尿酸钠盐化合物、焦磷酸钙盐脱水物和磷酸钙盐［12］。

印度刺猬蛋白属于刺猬信号通路蛋白家族，具有调节软骨细胞肥大、增殖以及软骨内成骨的明显作用。研究结果显示，KOA患者关节液中印度刺猬蛋白含量明显上升，印度刺猬蛋白的表达水平与膝关节软骨的损伤程度密切相关［13］。印度刺猬蛋白可通过诱导软骨细胞肥大，降解软骨基质以及促进MMP-13的表达，以促进KOA的发展进程。

PAP等［14］研究不同程度KOA患者不同层面软骨组织中MMP-3和uPA的表达情况，认为两者之间呈正相关，协同作用，共同加快软骨组织的降解。uPA/uPAR与细胞因子之间相互影响，相互调节，共同促进KOA的发病和进展。

目前，有26种MMPs被发现，按发现的先后顺序依次被命名为MMP-1到MMP-26。MMP-13在骨关节炎关节液中的表达明显增高，约为正常软骨的10倍［15］。研究发现，在KOA患者软骨损伤部位，软骨Ⅱ型胶原发生降解，并且同一区域的MMP-13 mRNA表达增强，增高程度与病变部位软骨损伤的破坏程度一致，也表明软骨损伤程度越严重，酶的表达程度越高；并且对比发现，软骨正常区域并未降解［16-17］。

本研究通过对120例KOA患者的关节液组分进行分析，发现KOA患者关节液中的印度刺猬蛋白水平、uPA在关节液中的表达水平和MMP-13的表达程度明显高于正常对照组，与患者后期康复水平呈现一致性，差异有统计学意义（P < 0.05）。这些临床研究结果表明，印度刺猬蛋白、uPA和MMP-13在KOA的发病机制中有着极其重要的地位。KOA的发病过程是漫长并且复杂的，至今尚未能完全产阐明。根据本研究结果，笔者认为，在KOA发病的早期，软骨细胞分泌很少量的uPA、MMP-13等细胞因子，这些细胞因子与其特异性抑制剂的比例处于一个平衡状态，但随着KOA的发展，这种平衡被打破。通过对患者关节液中细胞因子的表达水平检测，临床医师指导早期患者改正不良的生活方式和习惯，KOA的发病进程将会减速或者终止。对于KOA已经发展到一定程度的患者，通过检测关节液中uPA、印度刺猬蛋白和MMP-13的含量变化，可以为KOA的治疗效果提供参考指标，并且能够为临床医师更好地判断患者病情变化提供依据。

KOA的发生、发展是多种因素共同作用、共同参与的结果，笔者在研究的过程中试图发现更多与KOA发生相关的因素，并且期待找出它们之间的作用规律。希望本研究能够为临床医师判断疾病的进程、治疗效果，以及为KOA的治疗和预防提供一些参考依据。

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收稿日期：2022-04-15；修回日期：2022-06-01

作者單位：1.山东省泰山医院，山东 泰安 271099；2.泰安市中医医院，山东 泰安 271000；3.泰安市中心医院，山东 泰安 271000；4.山东景源生物科技有限公司，山东 泰安 271000

通信作者：田丽娜 山东省泰安市高新区北天门大街2957号，tianangelt@163.com