骆 璐，陈忠琼，谢建华，蒋佳利，凌洪权，欧阳吴莉，曾 政

(重庆市动物疫病预防控制中心，重庆 渝北 401120)

牛支原体(Mycoplasmabovis，M.bovis)是严重危害养牛业发展的一种重要传染性病原体，其能够引起肉牛和奶牛支气管炎、肺炎、关节炎和乳腺炎[1]。1961年，美国最早报道了一起由牛支原体感染引起的牛乳腺炎[2]，而后，随着牛及牛产品(牛乳、牛精液等)的国际贸易增加，该病原在世界范围内开始蔓延。2008年6月，我国湖北、重庆、甘肃、贵州、山东等地区相继发现了以肺肉变及坏死为主要特征的牛呼吸道传染病[3]，同年9月，辛九庆等首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体，标志着牛支原体在我国的定植[4]。

传染性牛支原体肺炎是由牛支原体引起的，以坏死性肺炎为主要特征的牛细菌性呼吸系统疾病，患病率达50%～100%，平均病死率为10%，高者可达40%，这给我国养牛业造成了严重的经济损失[5]。研究显示，该病原主要侵害3～12月龄的犊牛，牛一旦感染，可持续带菌并排菌。在生产实际中，大量使用抗菌药导致牛支原体的耐药性逐渐升高[6-7]。为有效防控该病并防止超级耐药菌的出现，已有大量研究报道了有关牛支原体灭活疫苗、亚单位疫苗等的研制，但国内外仍无商业化的有效疫苗可用于预防牛支原体感染[8]。

本试验采用临床分离到的3株牛支原体分离株感染犊牛，观察并记录感染犊牛的临床症状和体征，剖检观察肺部病变情况，采用实验室诊断方法对牛支原体感染情况进行分析，从而得出3株牛支原体分离株的特征，为疫苗株的筛选提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 牛支原体ELISA抗体检测试剂盒，购自北京宝威特生物技术有限公司；DL-2 000 DNA Marker，购自天根生化科技(北京)有限公司；PPLO Broth、PPLO Agar，均购自Becton Dickinson and Company；Yeast Extract、马血清，均购自赛默飞世尔科技公司；青霉素钠，购自成都科龙化工试剂厂；2×Taq酶，购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA/RNA抽提试剂盒，购自上海华舜生物技术有限公司；琼脂糖凝胶粉，购自上海普洛麦格生物产品有限公司；菌株保守序列扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 菌株 采用本实验室前期从患有严重呼吸道症状的病/死牛肺部分离到的3株牛支原体分离株，分别为W70株、Q3株和JX02株，由本实验室暂存。牛支原体的复苏培养和鉴定具体方法参照本实验室前期发表的文章[9]。复苏后的菌种用聚合酶链式反应(PCR)扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。引物序列：上游引物Mbl：5′-TTTAGCTCTCATTAGAACAAAT-3′；下游引物Mb2：5′-GCCTCTCTTTAAGAATGTC-3′。

1.3 试验动物 选择当地黄牛与西门塔尔牛冷冻精液人工配种得到的4～7月龄子代犊牛12头，经检测均为牛支原体阴性。所有受试犊牛雇佣专人负责看护、饲喂、清扫和日常管理。

1.4 试验设计 将12头准备进行人工感染的犊牛随机分为4个组，每组3头，分别是感染组(W70组、Q3组和JX02组)和阴性对照组。同组犊牛混群饲养，不同组犊牛饲养圈舍相距10 m以上。感染组采用气管环注射法进行感染，用30 mL注射器吸取20 mL浓度为1×109CCU/mL的病原菌液体培养物，在咽部下方、靠近气管上部，将注射器针头穿透颈部皮肤和肌肉层后，从两气管环状软骨中间连接处进针穿透气管，缓慢推注菌液至气管中。共人工感染2次，间隔时间7 d。阴性对照组采用相同方法、次数、剂量注射培养用的肉汤培养基。

1.5 犊牛人工感染牛支原体模型的建立 感染后30 d无菌剪取肺部病变组织，匀浆后涂布于固体培养基，挑取单菌落，采用煮沸法提取菌落DNA，进行PCR扩增及电泳，如感染组出现阳性条带，并结合观察到的临床症状，可判断气管环注射法使牛支原体在肺脏成功定植，犊牛人工感染牛支原体模型建立成功。

1.6 临床观察 感染后30 d内，每天观察犊牛的精神状态、食欲状况、反刍状态、被毛情况、眼鼻分泌物情况、临床三大体征(呼吸、脉搏、体温)等。

1.7 剖检观察和组织病理学检查 感染后30 d，剖检所有犊牛，观察肺部有无坏死灶、肺脏颜色变化情况、肺组织和胸腔粘连情况、胸腔积液情况、肺萎缩情况、肺部肉样变情况等。记录脏器病理变化情况并按照病理评分标准(表1)进行评分，评分标准参照参考文献[10]，并结合实际略作改动。剖检观察后，分别取阴性对照组正常肺部组织及感染组病变肺部组织，制成石蜡切片，在显微镜下观察组织病理学变化。

表1 病理评分标准[10]

1.8 血清抗体ELISA检测 从感染开始第1天起，连续每天对所有犊牛进行颈静脉采血，4 ℃静置过夜，分离血清，存放于-20 ℃，待30 d观察期结束后统一用ELISA法进行牛支原体血清抗体检测。

2 结果

2.1 犊牛人工感染牛支原体模型的建立 3株牛支原体人工感染后，感染组犊牛均在2～7 d后开始出现不同程度呼吸道症状。鼻孔开始大量分泌黏液，并伴有少量脓性分泌物，眼角有淡黄色脓性分泌物。偶见咳嗽、喷嚏，听诊有啰音，其中以W70组最为明显。阴性对照组未表现出明显的临床症状。剖检犊牛时无菌剪取肺部病变组织，匀浆后涂布于固体培养基，培养的菌落用PCR法进行检测，感染组出现阳性条带，确定为牛支原体。上述临床症状和实验室检测结果均证明本试验的动物模型建立成功。

2.2 临床三大体征监测 比较各组试验犊牛的脉搏、体温和呼吸频率的平均水平，结果如图1所示，阴性对照组和感染组的脉搏频率均在正常值范围内(72～100 次/min)[11]；W70组的体温和呼吸频率均在人工感染后的第2天逐渐升高，到第2次人工感染(第7天)后出现大幅上升，到第9天体温达到最高峰40.1 ℃，呼吸频率达到最高频次44 次/min；JX02组和Q3组也存在同样的趋势，但相对W70组幅度较小。

图1 临床三大体征变化

2.3 剖检观察 试验观察期结束后剖检试验犊牛结果显示，感染组犊牛的肺部均存在不同程度的病变，包括肺脏出血、萎缩，表面圆形暗红色坏死灶(图2A)，局部出现白色结节，肺部实变(图2B)，气管内有大量黏性分泌物等；阴性对照组犊牛肺部质地柔软，颜色呈粉红色，无病变(图2C)。根据病理评分标准，对各感染组犊牛进行分值累加并求平均数，结果W70组平均12.0分，JX02组平均7.3分，Q3组平均5.6分，阴性对照组未发现病理变化，记为0分，评分结果见表2。

表2 病变情况评分

图2 肺部剖检观察

2.4 组织病理学检查 通过光学显微镜观察肺部病理组织切片发现，阴性对照组肺小叶无肉眼可见病理变化(图3A)；W70组表现为肺泡壁增厚，肺泡腔内充满均质浆液，肺泡扩大，肺泡腔内充满大量的中性粒细胞，肺泡内纤维素性渗出物，红细胞大量溶血，中型粒细胞坏死、纤维素溶解，细支气管周边炎性浸润，大量中性粒细胞聚集，血管周边大量淋巴细胞浸润，黏膜(固有层)大量淋巴细胞浸润，肺萎陷等(图3B)；JX02组出现肺泡壁毛细血管红细胞溶血，肺泡萎陷，细支气管(终末)周边肺泡壁增厚，局部淤血(图3C)；Q3组出现细支气管黏膜下淋巴细胞浸润，肺泡壁增厚，周边肺泡壁部分塌陷，周边结缔组织增生，细支气管内有散落的纤维素和中性粒细胞(图3D)。

图3 肺部组织病理切片(H.E.染色，400×)

2.5 血清抗体ELISA检测 血清抗体检测发现，各感染组的抗体水平变化趋势相同。各感染组首次感染后血清抗体水平均有所升高，第2次感染后抗体水平均出现明显增长趋势，且均在感染后15 d时出现高峰，而后开始消减。其中W70组的抗体最高OD值可达1.24，直到试验结束时抗体OD值仍维持在0.74；JX02组的抗体OD值峰值为1.15，试验结束时消减至0.5，并有持续下降的趋势；Q3组在首次感染后抗体水平较另外2个感染组高，达到峰值(1.01)的时间更早，但其峰值较低，且最终维持的抗体水平也最低(0.44)，见图4。

图4 血清抗体水平

3 讨论

支原体在动植物以及人体中广泛存在，种类繁多，其中牛源支原体就有20多种[10]。为探究牛支原体的致病特性，本课题组前期通过牛支原体分离株感染健康鸡胚和BALB/c小鼠成功复制了牛支原体感染的病理模型，在小鼠感染模型中，通过致死率对牛支原体的毒力进行了初步评价，发现W70株对小鼠的毒力最强，其次是Q3株，最后是JX02株[12]。而本次犊牛的感染模型中，毒力强弱顺序依次为W70株>JX02株>Q3株，说明相同的菌株会因不同环境、不同接种方式、不同宿主等表现出不同的侵袭力。因此，在进行疫苗候选株筛选时，回归本体动物的攻毒试验是必不可少的环节。

通过对试验动物的临床症状观察表明，本试验采用的气管环注射法能够成功还原牛支原体肺炎感染模型，感染组犊牛均表现出体温升高、呼吸频率加快等症状，而W70组在感染约10 d时，体温和呼吸频率均超过了正常范围。此外，感染组犊牛还表现出咳嗽、流黏液性鼻液、眼部分泌物增多、腹式呼吸等临床症状，这与自然感染所报道的临床症状相似[13]。本试验感染组犊牛脉搏频率均在正常值范围内，表明脉搏频率受牛支原体感染的影响较弱。病理组织学检查结果显示，感染组犊牛的肺部组织均存在不同程度的病变，主要以间质性肺炎和纤维素性渗出性肺炎为主，其中W70组的肺部组织损伤最为严重，该结果也证明了W70株对牛的肺部有较高的致病性。

本试验血清抗体检测结果显示，无论是毒力较强的W70株还是其他2个毒力较弱的JX02株和Q3株，均在首次感染后约15 d时达到最高抗体水平，但高浓度的抗体水平持续时间较短，这也是支原体在牛群中难以消除、易反复感染的原因之一。提示在今后牛支原体疫苗的实际应用中，若要维持较高的抗体水平，还需更进一步制定合理的免疫程序和确定合适的免疫剂量。

本试验结果显示，牛支原体W70株、JX02株和Q3株对犊牛均有致病性，但W70株的毒力最强。结合本实验室前期研究成果[14]，这可能与W70株的全菌蛋白条带数量较多有关，牛支原体侵袭力与蛋白质表达量和功能的关系还有待进一步研究。总之，本试验成功筛选出W70株作为牛支原体疫苗候选株，同时也为后续蛋白质组学研究和牛支原体细胞感染模型的建立提供了思路。