于文昊 王海久（青海大学附属医院肝胆胰外科，西宁 810000）

胰腺癌是临床常见消化系统恶性肿瘤，近30年来其发病率在全球范围内呈上升趋势，且病死率较高，其早期症状不明显，缺乏特异性筛查指标，80%患者确诊时多已是中晚期，仅5%左右患者进行手术治疗，但五年生存率不足5%［1-3］。因此，探寻胰腺癌新型生物治疗靶标已成为临床研究热点。长链非 编 码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一种反义RNA分子，不具有蛋白编码能力，能与靶基因非编码区特异性结合，调节基因转录和表达而发挥促癌或抑癌作用［4］。核富集转录体1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）是lncRNAs家族成员之一，研究显示，其对多种恶性肿瘤如甲状腺癌、肝癌、舌鳞状细胞癌等细胞生物学行为均具有调控作用［5-7］。miR-497-5p属于miRNAs家族重要一员［8］，姜达伟等［9］研究显示，过表达miR-497-5p能够诱导胰腺癌细胞周期阻滞进而抑制细胞增殖。XIA等［10］研究显示，NEAT1靶向下调miR-497-5p表达促进胃癌细胞增殖并抑制凋亡。目前，有关NEAT1能否调控miR-497-5p影响胰腺癌细胞生物学行为的研究鲜有报道，因此本研究探讨NEAT1与miR-497-5p对胰腺癌细胞增殖、凋亡等的影响，以期为临床寻找胰腺癌新型生物治疗靶点提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人胰腺癌PANC-1细胞（bio-51676）购自北京百欧博伟生物技术有限公司。

1.1.2 试剂与仪器DMEM培养基（3-2001）、蛋白提取试剂盒（BC3711-50T）、LipofectamineTM3000转染试剂盒（EF010-E）购自美国艾美捷（武汉）科技有限公司；CCK-8试剂盒（CA1210-500T）、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（WK304）、反转录试剂盒（RP1105-100T）、AceQqPCR SYBR Green Mix（ALH185）、Trizol Reagent核酸分离试剂（YT526）、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（KFS303-HUV）购自北京百奥莱博科技有限公司；靶向NEAT1的特异性siRNA（NEAT1-siRNA）及无关序列siRNA-NC由上海普迈生物科技有限公司设计合成；miR-497-5p-inhibitor及相应阴性对照inhibitor-NC由百奥迈科生物技术有限公司合成；兔抗人细胞增殖相关核抗原（MKI67 Affinity Purified Polyclonal Ab，Ki-67）（100130-MM21）、B淋巴 细 胞 瘤 基 因-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（FTB3598S）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（ATA25287）、E-钙黏附蛋白（E-cadherin）抗体（货号ACRO）、间质标志物波形蛋白（Vimentin）（货号K26866-PGZ）、N-钙黏附蛋白（N-cadherin）抗体（货号M00403-FCZ）、β-actin（ABP57456）多克隆抗体、山羊抗兔HRP（SE12-0.1）二抗均购自武汉益普生物科技有限公司；二氧化碳细胞培养箱（型号：BBD6220）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；酶标仪（型号：ELx800）、荧光定量PCR仪（型号：C1000）购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪（型号：CytoFLEX）购自美国Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取PANC-1细胞解冻，复苏，置于含10%灭活胎牛血清（FBS）+DMEM培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养，每2～3 d换液，无菌操作，细胞已长满（达80%～90%）时进行传代培养。

1.2.2 细胞瞬时转染及分组处理 取1.2.1对数生长期的PANC-1细胞接种于24孔板（2.5×104个/孔），培养24 h后，更换无FBS的培养液，对细胞进行转染并分组：①空白对照组（NG组）：细胞不做特殊处理；②阴性转染组（siRNA-NC组）：采用LipofectamineTM3000将NEAT1-siRNA转染至PANC-1细胞中；③沉默NEAT1组（NEAT1-siRNA组）：采用LipofectamineTM3000将NEAT1-siRNA转染至PANC-1细胞中；④共转染组（NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor组）：采用LipofectamineTM3000将NEAT1-siRNA和miR-497-5p-inhibitor序列共转染。用含10%灭活FBS+DMEM培养液继续培养细胞48 h。严格按照转染试剂盒说明书操作，收集各组细胞用于后续实验。

1.2.3 实时定量聚合酶链反应检测NEAT1、miR-497-5p水平TRIzol法提取1.2.2各组培养48 h的PANC-1细胞总RNA并测定浓度。以RNA为模板、PrimeScript RT reagent试剂盒说明书为操作标准进行逆转录合成cDNA。体系20µl：ULtraSYBR mixture（10.0µl）、模板cDNA（2.0µl）、上下游引物（各2.0µl）、去离子纯化水（4.0µl）；93℃30 s、93℃5 s、65℃30 s，40个循环。引物序列详见表1，由苏州泓迅生物科技股份有限公司设计并合成。采用2-ΔΔCt方法计算NEAT1、miR-497-5p水平相对表达量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 CCK-8法检测各组PANC-1细胞增殖能力取1.2.2各组培养48 h后的PANC-1细胞，消化，接种至24孔板（2.5×104个/孔），继续培养48 h，严格按照CCK-8试剂盒说明书加入CCK-8试剂，继续培养2 h，检测490 nm处各孔细胞光密度（optical density，OD）值，计算细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。实验重复3次。

1.2.5 流式细胞术检测各组PANC-1细胞凋亡率取1.2.2各组培养48 h后的PANC-1细胞接种于24孔板中（2.5×105个/孔），按照Annexin-V FITC/PI试剂盒说明书处理细胞；加5µl碘化丙啶（PI）+5µl Annexin V-FITC混匀，染色，稀释，流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.2.6 Western blot检测增殖、凋亡及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）标志蛋白表达情况 以RIPA液裂解细胞，提取总蛋白并检测浓度及纯度，行10%SDS-PAGE电泳、转膜，以5%脱脂牛奶封闭，加入一抗Ki-67、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及内参β-actin，稀释比均为1∶500，4℃过夜，清洗，加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育1 h。分析各蛋白相对表达量。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验 数据库（Starbase）显示NEAT1与miR-497-5p核苷酸存在结合位点，根据miR-497-5p与NEAT1-3'UTR结合位点的预测结果，采用PCR技术扩增NEAT1-3'UTR序列中包含与miR-497-5p存在结合位点的片段，并插入到荧光素酶pGL4载体中，构建NEAT1野生型质粒（NEAT1-WT），并利用基因突变技术将个别结合位点序列突变，构建突变型质粒（NEAT1-MT）。使用LipofectamineTM3000将NEAT1-WT、NEAT1-MT分别与miR-497-5p-inhibitor-NC、miR-497-5p-inhibitor共转染于PANC-1细胞，分别为miR-497-5p-inhibitor-NC-NEAT1-WT组、miR-497-5p-inhibitor-NEAT1-WT组、miR-497-5p-inhibitor-NC-NEAT1-MT组、miR-497-5p-inhibitor-NC-NEAT1-MT组，转染48 h后，用PBS洗涤细胞，加入RIPA裂解液（250µl）于室温摇床中摇晃15 min裂解细胞，收集裂解液，加入50µl荧光素酶检测试剂Ⅱ，以自动荧光素酶检测仪测定荧光强度A，之后加入Stop＆Glo，测定荧光强度B，以A/B表示荧光素酶相对活性。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0分析数据，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组PANC-1细胞NEAT1、miR-497-5p水平比较 与NG组、siRNA-NC组比较，NEAT1-siRNA组PANC-1细胞NEAT1水平显著降低（P＜0.05），miR-497-5p水平显著升高（P＜0.05）；与NEAT1-siRNA组比较，NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor组PANC-1细胞NEAT1水平差异无统计学意义（P＞0.05），miR-497-5p水平显著降低（P＜0.05，表2）。

表2 各 组PANC-1细 胞NEAT1、miR-497-5p水 平 比较（±s，n=6）Tab.2 Comparison of NEAT1 and miR-497-5p levels in PANC-1 cells of each group（±s，n=6）

表2 各 组PANC-1细 胞NEAT1、miR-497-5p水 平 比较（±s，n=6）Tab.2 Comparison of NEAT1 and miR-497-5p levels in PANC-1 cells of each group（±s，n=6）

Note：Compared with NG group，1）P＜0.05；compared with siRNA-NC group，2）P＜0.05；compared with NEAT1-siRNA group，3）P＜0.05.

Groups NG siRNA-NC NEAT1-siRNA NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor F P NEAT1/β-actin 0.99±0.15 1.00±0.15 0.55±0.081）2）0.53±0.071）2）271.020 0.000 miR-497-5p/U6 1.01±0.16 0.98±0.15 1.55±0.231）2）1.20±0.181）2）3）130.270 0.000

2.2 各组PANC-1细胞增殖情况比较 与NG组、siRNA-NC组比较，NEAT1-siRNA组PANC-1细胞增殖抑制率显著升高（P＜0.05）；与NEAT1-siRNA组比较，NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor组PANC-1细胞增殖抑制率显著降低（P＜0.05，表3）。

表3 各组PANC-1细胞增殖情况比较（±s，n=6）Tab.3 Comparison of PANC-1 cell proliferation in each group（±s，n=6）

表3 各组PANC-1细胞增殖情况比较（±s，n=6）Tab.3 Comparison of PANC-1 cell proliferation in each group（±s，n=6）

Note：Compared with NG group，1）P＜0.05；compared with siRNA-NC group，2）P＜0.05；compared with NEAT1-siRNA group，3）P＜0.05.

Groups NG siRNA-NC NEAT1-siRNA NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor F P Cell proliferation inhibition rate（%）0.00 0.08±0.01 22.87±3.431）2）15.12±2.271）2）3）939.753 0.000

2.3 各组PANC-1细胞凋亡情况比较 与NG组、siRNA-NC组比较，NEAT1-siRNA组PANC-1细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与NEAT1-siRNA组比较，NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor组PANC-1细 胞凋亡率显著降低（P＜0.05，图1、表4）。

表4 各组PANC-1细胞凋亡情况比较（±s，n=6）Tab.4 Comparison of PANC-1 cell apoptosis in each group（±s，n=6）

表4 各组PANC-1细胞凋亡情况比较（±s，n=6）Tab.4 Comparison of PANC-1 cell apoptosis in each group（±s，n=6）

Note：Compared with NG group，1）P＜0.05；compared with siRNA-NC group，2）P＜0.05；compared with NEAT1-siRNA group，3）P＜0.05.

Groups NG siRNA-NC NEAT1-siRNA NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor FP Apoptosis rate（%）15.69±2.35 17.01±2.55 40.05±6.061）2）27.88±4.191）2）3）558.343 0.000

图1 各组PANC-1细胞凋亡情况比较Fig.1 Comparison of PANC-1 cell apoptosis in each group

2.4 各组PANC-1细胞增殖、凋亡及EMT相关蛋白表达比较 与NG组、siRNA-NC组比较，NEAT1-siRNA组PANC-1细胞Ki-67、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表达显著降低（P＜0.05），Bax、E-cadherin蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与NEAT1-siRNA组比较，NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor组PANC-1细胞Ki-67、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表达显著升高（P＜0.05），Bax、E-cadherin蛋白表达显著降低（P＜0.05，图2、表5）。

表5 各组PANC-1细胞增殖、凋亡及EMT相关蛋白表达比较（±s，n=6）Tab.5 Comparison of proliferation，apoptosis and EMT related protein expressions of PANC-1 cells in each group（±s，n=6）

表5 各组PANC-1细胞增殖、凋亡及EMT相关蛋白表达比较（±s，n=6）Tab.5 Comparison of proliferation，apoptosis and EMT related protein expressions of PANC-1 cells in each group（±s，n=6）

Note：Compared with NG group，1）P＜0.05；compared with siRNA-NC group，2）P＜0.05；compared with NEAT1-siRNA group，3）P＜0.05.

Groups NG siRNA-NC NEAT1-siRNA NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor FP Ki-67/β-actin 1.18±0.18 1.20±0.19 0.57±0.091）2）0.85±0.131）2）3）191.436 0.000 Bax/β-actin 0.33±0.04 0.35±0.05 0.97±0.161）2）0.67±0.111）2）3）699.870 0.000 Bcl-2/β-actin 0.95±0.14 0.96±0.15 0.30±0.051）2）0.71±0.111）2）3）305.653 0.000 E-cadherin/β-actin 0.55±0.08 0.58±0.09 1.17±0.251）2）0.87±0.131）2）3）273.400 0.000 N-cadherin/β-actin 1.21±0.18 1.19±0.19 0.52±0.081）2）0.79±0.121）2）3）240.613 0.000 Vimentin/β-actin 1.17±0.18 1.19±0.19 0.60±0.091）2）0.83±0.121）2）3）178.955 0.000

图2 各组PANC-1细胞增殖、凋亡及EMT相关蛋白表达比较Fig.2 Comparison of proliferation，apoptosis and EMT related protein expression of PANC-1 cells in each group

2.5 双荧光素酶报告基因检测NEAT1对miR-497-5p的转录调控Starbase（http：//starbase.sysu.edu.cn/degradomeRNA.php？source=mRNA）预测结果显示，NEAT1与miR-497-5p基因序列存在结合位点，见图3。荧光素酶报告基因实验结果显示，转染NEAT1 WT的实验中，miR-497-5p-inhibitor-NEAT1-WT组荧光素酶活性（1.37±0.21）显著高于miR-497-5p-inhibitor-NC-NEAT1-WT组（1.03±0.15），（P＜0.05，图4）。

图3 NEAT1与miR-497-5p基因靶向关系Fig.3 Targeting relationship between NEAT1 and miR-497-5p gene

图4 荧光素酶实验结果Fig.4 Results of luciferase experiment

3 讨论

胰腺癌是消化系统恶性肿瘤，具有发病隐匿、侵袭性强特点，导致大多数患者确诊时已是中晚期［11］。目前手术及化疗手段是临床治疗胰腺癌的主要手段，但手术对于浸润程度深的患者有较大风险，同时疗效有一定局限性，而肿瘤细胞对化疗药物耐药性又限制了化疗药物的广泛应用及疗效。

NEAT1是新近发现的一个lncRNA，能够参与多种基因转录调控，研究表明，其作为癌基因参与多种肿瘤发生发展［12］。郭春芳等［13］研究显示，NEAT1在卵巢癌组织中异常高表达可能是卵巢癌潜 在 治 疗 靶 点。WANG等［14］研 究 显 示，过 表 达NEAT1显著促进子宫内膜癌细胞增殖、侵袭等。细胞增殖及凋亡失衡是肿瘤发生发展的关键，而EMT是指上皮细胞在正常生理及病理特征下向间质细胞表型的转变过程，是肿瘤细胞发生迁移和侵袭的关键步骤［15-16］。其中上皮细胞标志蛋白E-cadherin及间质细胞标志蛋白N-cadherin、Vimentin是EMT标志蛋白，E-cadherin表达下调及N-cadherin、Vimentin表达上调，胞间黏附作用减弱，进一步促使癌细胞向周边正常组织发生侵袭、转移［17-18］。本研究结果显示，与NG组、siRNA-NC组比较，NEAT1-siRNA组PANC-1细胞增殖抑制率、凋亡率、Bax、Ecadherin蛋白表达显著升高，NEAT1水平及Ki-67、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表达显著降低。与既往肿瘤研究中表达模式一致，说明沉默NEAT1表达可能抑制胰腺癌细胞增殖、EMT过程并诱导细胞凋亡。miR-497-5p是一种单链小分子RNA，位于肿瘤易突变区域人类染色体17q13.1，在多种肿瘤中异常低表达［19］。LIU等［20］研究显示，miR-497可能通过抑制血管内皮生长因子-A表达抑制胰腺癌细胞增殖、血管生成和转移能力。本研究结果显示，与NG组、siRNA-NC组比较，NEAT1-siRNA组PANC-1细胞miR-497-5p水平显著升高，当在转染NEAT1-siRNA基础上抑制miR-497-5p表达后，沉默NEAT1表达抑制PANC-1细胞增殖并诱导细胞凋亡能力减弱，说明沉默NEAT1表达可能通过上调miR-497-5p表达发挥抑癌作用。研究发现，NEAT1可对miR-497-5p发挥负调控作用促进胃癌细胞增殖并抑制凋亡［10］。本研究经生物信息学预测网站得知NEAT1与miR-497-5p基因序列存在结合位点，且经双荧光素酶报告实验证实，miR-497-5p-inhibitor-NEAT1-WT组荧光素酶活性显著高于miR-497-5pinhibitor-NC-NEAT1-WT组。以上研究结果表明，沉默NEAT1表达可能靶向上调miR-497-5p表达，抑制胰腺癌细胞增殖及EMT过程，并诱导细胞凋亡。

综上所述，沉默lncRNA NEAT1表达能抑制胰腺癌细胞增殖及EMT过程，并诱导细胞凋亡，可能是通过靶向上调miR-497-5p实现的。然而胰腺癌发生发展是多因素的复杂过程，关于其细胞增殖、凋亡等生物学恶性行为进展中lncRNA NEAT1对下游靶基因或相关通路的调控作用仍需深入探索。