刘旭初，覃世运，陈丽君，陈 娟，尤晓光

1 海南省第三人民医院(三亚中心医院)a.肿瘤治疗中心, b.药学部，海南 三亚 572000；2 海南医学院第一附属医院 放射科，海口 570102

原发性肝癌作为临床最为常见的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和死亡率，是最为常见的癌症相关性死亡原因之一[1-2]。由于原发性肝癌发病隐匿，患者缺乏早期典型的临床症状，大部分患者在临床确诊时已经处于疾病的中晚期阶段，能够进行根治性手术切除的患者比例甚至不足20%。经肝动脉化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)是中晚期原发性肝癌患者治疗的主要手段，可有效改善患者临床预后[3-5]。然而，当前仍缺乏评价中晚期肝癌TACE术后预后的有效方式。研究[6-7]显示，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号通路是原发性肝癌发生发展的关键。KRAS基因属于Ras原癌基因家族中的一员，不仅是抗EGFR靶向治疗选择的重要依据，同时也可能成为患者预后的预测因子。本研究探讨KRAS基因状态对TACE治疗中晚期肝癌患者预后的预测价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2017年4月—2020年5月在海南省第三人民医院接受TACE治疗的中晚期肝癌患者为研究对象。纳入标准：(1)患者均经穿刺活检，临床病理诊断为原发性肝癌患者；(2)心、肺、肾等机体主要器官功能无明显障碍患者；(3)巴塞罗那肝癌临床分期(BCLC)B期或C期患者；(4)肝功能Child-Pugh分级为A级或B级患者；(5)无法接受外科手术治疗切除患者；(6)卡氏(KPS)评分>60分；(7)术前未接受其他治疗。排除标准：(1)合并严重凝血功能障碍患者；(2)大量腹水或顽固性腹水患者；(3)有TACE治疗禁忌证患者；(4)合并远处转移患者。

1.2 TACE治疗方法 使用Seldinger法穿刺患者股动脉，插管直至肝总动脉进行造影，以明确肿瘤大小、数目、位置。以微导管超选择插管至支配肝癌病灶的主要供血动脉内，将化疗药物(氟尿嘧啶750 mg/m2，奥沙利铂60 mg/m2)稀释液缓慢注入，然后使用15～25 mL 40%碘化油栓塞肿瘤末梢血管。若有必要可使用明胶海绵颗粒，以尽可能完全阻断患者肿瘤血供。根据患者肿瘤大小、数量以及患者肝功能具体情况确定碘化油及栓塞剂的使用剂量。此外，根据患者情况决定TACE治疗次数，本研究患者治疗2～3次。

1.3 KRAS基因检测 TACE手术前，在超声引导下对肝癌组织进行穿刺取材，取5 g左右肿瘤组织，按照QIAamp DNAFFPF Kit试剂盒(Qiagen公司)步骤提取肿瘤组织DNA，使用紫外分光光度计检测提取DNA浓度，然后调节浓度至100 μg/mL，-20 ℃保存待测。扩增KRAS基因12/13号密码子特需特异性引物，根据文献[8]报道，引物序列，正义：5′-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3′，反义：5′-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3′。引物及Premix PCR试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司，PCR反应体系50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 40 s，共完成30个循环，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，选取PCR阳性凝胶条带作为目的片段，使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen公司)对PCR产物回收，然后送至上海基因技术有限公司进行测序分析。

1.4 随访 所有患者在接受TACE术后，每月复查肝功能、AFP、肝脏增强CT或MRI，以评估患者肿瘤控制情况以及术后复发情况，记录患者无进展生存期(PFS)以及总体生存期(OS)。PFS指的是从患者TACE术后到观察到疾病进展或发生死亡(由于任何原因)之间的时间；OS指的是从患者TACE术后到患者死亡(由于任何原因)之间的时间。

2 结果

2.1 KRAS基因突变检测结果 97例患者中男61例、女36例，年龄30～78岁，平均(56.48±12.31)岁。肿瘤最大径2.89～9.74 cm，平均(7.19±2.08)cm；肿瘤单个89例、≥2个18例。在本组97例晚期肝癌患者中，共检出KRAS基因突变患者34例(35.05%)，其中检出12号密码子突变患者21例(61.76%)，13号密码子突变患者13例(38.24%)。在检出KRAS基因突变患者中，均为单个碱基的点突变，而并未检出两个或两个以上碱基突变或其他形式的突变(图1)。

注：a,KRAS基因12、13密码子野生型基因序列；b,KRAS基因12密码子GGT→GAT突变；c,KRAS基因12密码子GGT→GTT突变；d,KRAS基因13密码子GGC→GAC突变。

2.2 KRAS基因突变状态与患者临床病理特征的关系 KRAS基因突变型与野生型比较，肝内转移、肿瘤数目的差异均有统计学意义(χ2值分别为3.965、6.593，P值均<0.05)(表1)。

表1 KRAS基因突变状态与患者临床特征的关系

2.3 KRAS基因突变状态与患者生存分析 对本组97例患者进行追踪随访显示，KRAS基因野生型患者平均PFS为11.35个月，突变型患者平均PFS为19.65个月；KRAS基因野生型患者平均OS为19.18个月，突变型患者平均OS为26.54个月。Kaplan-Meier生存分析结果显示，KRAS基因野生型患者PFS及OS均显著优于KRAS突变型(P值均<0.05)(图2、3)。

图2 KRAS基因状态与患者PFS的关系

2.4 影响患者预后的Cox分析 对可能影响患者总体生存预后的各因素进行Cox分析，结果显示，KRAS基因状态(RR=18.273,95%CI：5.584～98.305)、肝内转移(RR=11.475,95%CI：3.029～56.490)、肿瘤数目(RR=10.038,95%CI：2.973～19.328)、BCLC分期(RR=12.384,95%CI：2.385～29.305)与患者预后密切相关，为影响患者总体生存预后的重要因素(P值均<0.05)(表2)。

表2 影响患者预后的Cox分析

图3 KRAS基因状态与患者OS的关系

3 讨论

目前，TACE已经成为无法外科切除中晚期肝癌患者的首选治疗方式。肝癌的主要供血为肝动脉供血。经肝动脉碘油注射后，碘油可在肝癌的组织间隙、肝窦以及细小血管内选择性停滞，从而导致癌细胞失去血液供应而导致肿瘤组织缺血坏死[9-10]；在碘油中混合化疗药物，从而使化疗药物在肿瘤组织中缓慢释放，延长了化疗药物与肿瘤细胞之间的接触时间，进而显著提高化疗药物治疗效果，同时可显著减小化疗药物对患者全身的不良影响，并阻断肿瘤血供，引起肿瘤组织发生缺血性坏死，进一步增加抗肿瘤疗效[11-12]。研究提出[13-14]，采取非手术多模式治疗，尤其对于原发性肝癌患者采取TACE治疗，可有效延长患者生存期，在中晚期肝癌的治疗中具有重要作用。

原发性肝癌是多基因、多分子、多通路间相互作用的结果，因此检测原发性肝癌患者基因突变状况，对于患者治疗反应以及生存预后具有预测价值，从而有助于实现精准化治疗的目的[15-16]。KARS基因突变在原发性肝癌患者中具有着较高的发生率。研究[17-18]显示，原发性肝癌的发生是一种多步骤过程，而在肿瘤恶性发生的整个过程中，均与KRAS基因突变有关。有研究[19-20]认为，KRAS基因突变被认为是原发性肝癌发生的启动性因子，尤其G-A碱基突变，可能在多种恶性肿瘤发生中具有重要作用。

本研究结果显示，在本组97例中晚期肝癌患者中，共检出KRAS基因突变患者34例(35.05%)，其中检出12号密码子突变患者21例(61.76%)，13号密码子突变患者13例(38.24%)，且检出的患者均为单个碱基突变。本组结果与相关研究报道结果基本一致[21]。KRAS基因突变率接近35%，是一种较为常见的基因突变形式。此外，KRAS基因突变与患者肝硬化、肝内转移、肿瘤数目有关。提示KRAS基因突变的存在可能与肝癌疾病的发生发展具有一定的内在联系，从而为KRAS突变可能成为预测患者治疗预后的因素提供一定的基础。

Kaplan-Meier生存分析结果显示，KRAS基因野生型患者PFS及OS均显著优于KRAS突变型。表明了KRAS基因状态与患者TACE术后生存状况密切相关。KRAS基因野生型患者可受上游EGFR信号通路的调控，而当KRAS基因发生点突变时，导致该基因编码P21蛋白的空间结构发生了相应的变化，不再受上游EGFR信号的调控。KRAS基因突变亚型不同，可能也会导致该基因的空间构象发生变化，引起相应的调节细胞内信号通路不同，从而影响化疗药物的结合位点，也可能导致患者对化疗药物的敏感性有所差别，进而影响患者预后。

同时，本研究进一步对可能影响患者术后预后的各因素进行Cox回归分析，结果显示，KRAS基因状态、肝内转移、肿瘤数目、BCLC分期进入回归模型，为影响患者总体生存预后的重要因素。肿瘤数目、肝内转移以及BCLC分期均可有效提示原发性肝癌患者自身状态及肿瘤的进展情况，故而可影响患者预后，而KRAS基因状态同样进入了Cox回归模型，提示KRAS基因状态也对患者临床预后有着重要的影响。此外，通过Kaplan-Meier生存分析以及Cox多因素分析，进一步确定了KRAS基因状态与患者TACE术后预后具有密切关系，可能成为预测患者术后预后的重要因素之一。KRAS基因突变，可能是导致患者术后预后较差的因素，因此关注肝癌TACE患者KRAS基因状态，对于提前制订相关治疗计划具有重要价值。

但是由于本研究纳入样本量相对较小，研究结果可能存在一定的偏差，后期研究将进一步扩大研究样本量，以获得更为可靠的临床研究数据。

综上所述，KRAS基因突变在原发性肝癌中较为常见，与患者TACE术后不良预后密切相关，可成为患者临床预后监测的潜在指标。

伦理学声明：本研究方案于2017年1月8日经海南省第三人民医院伦理委员会审批，批号：伦(审)2017-09，所纳入患者均签署知情同意书。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：刘旭初、覃世运、陈丽君、陈娟、尤晓光负责课题设计，资料分析，撰写论文；刘旭初负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。