方 瑜，李 楠，吕汪洋

(浙江理工大学纺织纤维材料与加工技术国家地方联合工程实验室，杭州 310018)

有害细菌在自然界中分布范围广泛，十分容易被人体接触，严重威胁着人类的身体健康。细菌感染是世界上主要的公共卫生挑战之一[1]，其中治疗细菌感染最广泛使用的方法是抗生素。但是由于耐药细菌菌株的发展，传统抗生素的效率正在下降[2]。这迫切要求开发高效的不易引起细菌耐药性的抗菌材料[3- 4]。

无机抗菌材料通常不易产生耐药性，因此引起了不同学科的高度关注[5]。在现有的无机抗菌材料中，氧化锌(ZnO)是一种很有前途的抗菌剂，具有良好的热稳定性、高抗菌活性和优异的生物相容性[6-8]。ZnO对广谱细菌表现出优异的抗菌性能[9]，且ZnO与细菌之间的相互作用当ZnO粒子缩小到纳米级尺寸时更加有效，细菌大多致死。纳米氧化锌(ZnO NPs)对细胞无毒且具有生物相容性[10-11]。ZnO NPs的潜在抗菌机理是ZnO NPs可以向外界环境提供电子，从而产生可以有效杀死细菌的自由基[12]。然而，由于需要光照射的使用条件，难以将ZnO NPs应用于更广泛的使用环境。

纳米铜(Cu NPs)具有优异的抗菌性能，引起了广大研究人员的关注，其抗菌机理处于研究阶段[13-16]。与Ag或Zn化合物相比，Cu NPs具有更高效的抗菌性能和更低的成本。此外，纳米颗粒的高活性使其容易团聚，这限制了抗菌活性的正常发挥[17-18]。因此，在某种载体材料上负载Cu NPs有利于解决其分散性问题。基于上述条件，ZnO NPs可以作为纳米颗粒的载体材料，实现协同抗菌。此外，单一类型的抗菌剂在实际应用中具有一定的局限性，因此，制备多组分的复合抗菌剂迫在眉睫。在通常情况下，抗菌剂大多以粉末的形式存在，在实际应用中容易沉积团聚，不利于回收，因此有必要将抗菌剂粉末负载于一定的载体来解决分散和回收的问题。其中，聚丙烯腈(PAN)纤维具有良好的光学、化学、热稳定及亲水性能，是粉末抗菌剂的合适载体。

本文通过原位还原法将Cu NPs负载到ZnO NPs上，制备得到复合抗菌剂Cu-ZnO NPs，并通过离心-静电纺丝技术制备得到Cu-ZnO/PAN纤维，采用扫描电镜、透射电镜、红外光谱仪等对其进行表征，以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)和大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)作为目标菌种进行抗菌实验测试其抗菌性能，并通过抑菌圈实验、电子顺磁共振自旋捕获技术研究抗菌机理，为阐明Cu-ZnO/PAN纤维的抗菌机制提供理论依据。

1 实 验

1.1 实验材料

纳米氧化锌(ZnO NPs)和L-抗坏血酸购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；氯化铜(II)二水合物(CuCl2·2H2O)购自天津博迪化工有限公司；聚丙烯腈(PAN)购自北京百灵威科技有限公司；N, N-二甲基甲酰胺(DMF)购自杭州高晶精细化工有限公司；大肠杆菌菌种(E.coli)和金黄色葡萄球菌菌种(S.aureus)购自上海鲁微科技有限公司。所有实验均使用去离子水，所有化学试剂均为分析纯，未经进一步纯化。

1.2 Cu-ZnO NPs复合抗菌剂的制备

将ZnO NPs (2.00 g)超声分散至50 mL去离子水中(超声时间30 min，频率40 kHz)，将CuCl2·2H2O (0.27 g)溶解在50 mL去离子水中制备得到CuCl2·2H2O水溶液。将装有ZnO NPs和CuCl2·2H2O水溶液的烧瓶在80 ℃下回流冷凝，边搅拌边将50 mL L-抗坏血酸水溶液(6.25 mmol)逐滴滴加到烧瓶中。混合溶液在80 ℃下搅拌20 h，直到获得深色溶液。所得产物通过无水乙醇和去离子水洗涤离心分离，最后冷冻干燥，即得到Cu-ZnO NPs复合抗菌剂。

1.3 Cu-ZnO/PAN抗菌纤维的制备

制备质量分数为10%的聚丙烯腈溶液：称取1.57 g PAN在20 mL样品瓶中，加入15 mL DMF，通过超声分散和磁力搅拌，得到透明均匀粘稠的溶液。

制备不同比例的Cu-ZnO/PAN溶液，称取不同质量的Cu-ZnO NPs复合抗菌剂(Cu-ZnO NPs的质量分数分别为2.5%、5%、7.5%和10%)加入到PAN溶液中，磁力搅拌24 h得到均匀粘稠的纺丝溶液。通过离心-静电纺丝技术将纺丝液进行纺丝，纺丝参数如下：纺丝电压为12 kV，转速为 3 000 r/min，接收距离为11 cm，纺丝针头为 27 G，其内径为0.21 mm。得到不同比例抗菌剂的纺丝纤维。

1.4 材料表征

采用Zeiss Gemini SEM 500型号的场发射扫描电子显微镜(SEM)和JEOL JEM 2100F型号的透射电子显微镜(TEM)对抗菌剂和纤维的形貌进行分析测定。采用Agilent ICP-MS 7700型号的电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定抗菌剂和纤维中的铜含量。采用VERTEX 70型号的傅里叶变换红外光谱(FTIR)在4 000～400 cm-1的波数扫描范围内分析抗菌剂和纤维的化学结构和化学环境。采用Bruker D8 Discovery型号的X射线衍射(XRD)分析抗菌剂和纤维的晶体结构。采用Thermo Scientific K-alpha型号的X射线光电子能谱(XPS)研究抗菌剂和纤维的表面化学成分。采用Bruker A300 Germany型号的电子顺磁共振自旋捕获技术检测电子顺磁共振(EPR)信号，在室温下用5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)和2,2,6,6-四甲基哌啶(TEMP)捕获剂捕获自由基。

1.5 抗菌性能测试

按照GB/T 20944.3—2008《纺织品 抗菌性能的评价 第3部分：振荡法》规定的测试方法，在黑暗条件下选用典型的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)和革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)作为测试菌种来评价纤维的抗菌性能。利用平板计数法测定细菌增殖情况，按照式(1)计算抑菌率：

(1)

式中：Y是试样的抑菌率，A和B分别是抗菌纤维(或未抗菌处理纤维)试样恒温振荡18 h后和空白对照离心管内的菌落数。

1.6 耐水洗性能测试

参考FZ/T 73023—2006《抗菌针织品》附录C的简化洗涤条件及程序，对Cu-ZnO/PAN抗菌纤维试样进行标准洗涤。用标准规定的AATCC 1993标准洗涤剂2 g/L溶液作为洗涤液，将试样与洗涤液按照浴比1∶30放入样品瓶中，将样品瓶放入水浴恒温振荡器中，以振荡频率150 r/min、水温40 ℃、振荡洗涤5 min，洗涤结束后取出试样，用去离子水清洗数次作为1次洗涤过程。按照上述洗涤程序，自行设定洗涤时间为50、100、150、200 min和 250 min，即水洗10、20、30、40次和50次。每个试样做3个平行样，在黑暗条件下利用平板计数法测定细菌增殖情况，根据式(1)计算抑菌率评价试样的耐水洗性能。

2 结果与讨论

2.1 表征分析

图1为Cu-ZnO NPs、PAN和Cu-ZnO/PAN的SEM照片。图1(a)—(b)展示了Cu-ZnO NPs的微观形貌，图中未看到明显的大颗粒物质，说明其分散性较好，不易团聚；图1(c)—(f)分别为PAN和Cu-ZnO/PAN纤维的形貌照片，纤维表面相对干净光滑，形貌相比并没有发生明显变化，说明抗菌剂的存在对于纤维的形貌结构没有较大影响。

图1 Cu-ZnO NPs、PAN和Cu-ZnO/PAN的SEM照片Fig.1 SEM images of Cu-ZnO NPs, PAN and Cu-ZnO/PAN

样品的微观形貌结构通过透射电子显微镜确定，图2是Cu-ZnO NPs和Cu-ZnO/PAN的TEM照片。图2(a)—(b)展示了Cu-ZnO NPs的微观结构，从图2(a)—(b)中可以看出，复合抗菌剂中 Cu NPs 和 ZnO NPs 相互堆叠。Cu-ZnO/PAN的TEM照片如图2(c)—(d)所示，从图2(c)—(d)中可以清晰地看出，Cu-ZnO/PAN表面较粗糙，有黑色物质半嵌入半裸露在纤维表面。此外，纤维内部也有黑色块状物，可能是PAN纤维内部Cu-ZnO NPs的堆叠。结果表明，在PAN纤维中有大量的Cu-ZnO NPs或嵌入，或裸露在纤维的内部和表面，说明已成功制备得到 Cu-ZnO/PAN纤维。进一步利用TEM-EDX mapping分析Cu-ZnO/PAN的元素分布以及Cu-ZnO NPs在纤维中的分布情况，结果如图3所示。从图3中可以看出，复合抗菌剂中含有Zn、O和Cu元素，故通过原位还原法将Cu NPs还原到ZnO NPs上，其Cu元素与Zn和O元素分布基本一致，说明成功制备得到Cu-ZnO NPs且已负载至PAN纤维上。

图2 Cu-ZnO NPs和Cu-ZnO/PAN的TEM照片Fig.2 TEM images of Cu-ZnO NPs and Cu-ZnO/PAN

图3 Cu-ZnO/PAN的元素面扫描照片Fig.3 Elemental mapping images of Cu-ZnO/PAN

采用ICP-MS测定了Cu-ZnO NPs及Cu-ZnO/PAN中Cu元素的具体含量，结果如表1所示。Cu2+的标准工作曲线如图4所示。根据Cu元素的标准工作曲线，结合表1的数据，可以计算出 61.80 mg Cu-ZnO NPs中的Cu含量为 27957.16 mg/kg，17.50 mg Cu-ZnO/PAN中的Cu含量为1098.17 mg/kg，由此推算出Cu-ZnO NPs和Cu-ZnO/PAN中Cu含量分别为2.80%和0.11%。

表1 Cu-ZnO NPs和Cu-ZnO/PAN的ICP测试结果Tab.1 ICP test results of Cu-ZnO NPs and Cu-ZnO/PAN

图4 电感耦合等离子体原子发射光谱中Cu2+的标准工作曲线Fig.4 Standard working curve of Cu2+ in inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy

通过XRD分析研究了Cu-ZnO NPs、PAN和Cu-ZnO/PAN纤维，得到的数据如图5所示。如图5(a)所示，2θ=31.8°、34.5°、36.3°、47.6°、56.7°、62.9°、68.0°和69.2°处的8个特征峰归因于(100)、(002)、(101)、(102)、(110)、(103)、(112)和(201)晶面，分别对应于ZnO NPs的六方纤锌矿相(PDF卡 75-0576)[19-20]。图5(a)中强而窄的衍射峰表明ZnO NPs具有高度的结晶度[21]。此外，在2θ=43.3°、50.4°和74.1°处有3个尖锐且高强度的衍射峰，分别对应于Cu NPs的(111)、(200)和(220)晶面(PDF卡 85-1326)[22]，说明已成功制备Cu-ZnO NPs复合抗菌剂。除了ZnO NPs和Cu NPs，在XRD图中没有观察到其他特征峰，这证实了合成的Cu-ZnO NPs复合物的高纯度。结合XRD谱图通过Scherrer公式，可计算得出Cu NPs的大小为22.97 nm。此外，负载纤维后Cu-ZnO NPs特征峰明显消失的原因是粉末状抗菌剂的比例较低。如 图5(b) 所示，随着抗菌剂的含量增加，衍射峰逐渐变强，说明已成功制备Cu-ZnO/PAN纤维。

图5 复合抗菌剂和不同抗菌剂含量的纤维的XRD图Fig.5 XRD patterns of composite antibacterial agent and fibers with different antibacterial agent contents

Cu-ZnO NPs、PAN和Cu-ZnO/PAN的傅里叶红外光谱图(FTIR)如图6所示。从PAN的FTIR图可知，在2 939 cm-1观察到的吸收峰归因于CH2基团的C—H伸缩振动，2 244 cm-1处的吸收峰与聚合物链中丙烯腈单元的C≡N拉伸有关，1 627 cm-1观察到的弱吸收峰归因于羰基中的 C=C 振动，位于1 454 cm-1的CH2基团中的C—H拉伸振动和1 365 cm-1的C—H拉伸振动的两条谱带是沿着PAN主链的脂肪族CH基团的特征。1 226 cm-1处的谱带归属于醋酸盐中的C—O振动，而在1 074 cm-1处的C—O基团与1, 2, 3丙三醇的碳原子相连。对Cu-ZnO NPs来说，在1 640 cm-1和3 450 cm-1观察到的相对强烈的吸收峰归因于O—H弯曲和O—H伸缩振动，453 cm-1处的特征吸收峰归因于ZnO NPs的Zn—O键伸缩振动。而Cu-ZnO/PAN和PAN的特征峰基本相似，这可能是因为纤维所负载的Cu-ZnO NPs含量较少。

图6 抗菌剂和纤维的FTIR图Fig.6 FTIR spectra of antibacterial agent and fibers

Cu-ZnO NPs、PAN和Cu-ZnO/PAN的X射线光电子能谱图(XPS)如图7所示。从图7(a) XPS全谱中可以看出Cu-ZnO/PAN纤维表面主要存在C、N、O、Cu、Zn元素。图7(b)为Cu 2p的高分辨谱图，从中观察到Cu 2p1/2和Cu 2p3/2峰。此外，Cu 2p1/2和Cu 2p3/2区域之间的峰差异为 19.85 eV，这证实了仅存在Cu0/Cu+。一般来说，在Cu0/Cu+区域观察到的主峰无法区分，因为彼此的结合能值非常接近[23]。结合XRD测试结果可以得出，实验中大部分生成的是铜纳米粒子。图7(c)为Zn 2p的高分辨谱图，从图7(c)中可以看出，Zn 2p 有两个拟合峰，分别位于1 044.4和 1 021.3 eV，分别归因于Zn 2p1/2和Zn 2p3/2[24]，表明Cu-ZnO NPs和Cu-ZnO/PAN表面的Zn化学价为+2，进一步证明了 Cu-ZnO NPs和Cu-ZnO/PAN的成功制备。

图7 Cu-ZnO NPs、PAN和Cu-ZnO/PAN的XPS图Fig.7 XPS spectra of Cu-ZnO NPs, PAN and Cu-ZnO/PAN

2.2 抗菌性能分析

抗菌剂的含量是影响纤维抗菌性能的关键因素。通过比较样品和空白对照的菌落增殖和抑菌率来评价Cu-ZnO/PAN纤维的抑菌性能。图8(a)和图8(b)显示，与空白对照相比，未经处理的PAN纤维本身不具有抗菌能力。由于纤维具有一定的厚度和吸附能力，菌落数略有减少，抑菌率低于20%。Cu-ZnO/PAN纤维对E.coli和S.aureus具有一定的抑菌作用，且随着抗菌剂含量的增加，纤维的抑菌率逐渐提高。此外，由图8(c)可知，抗菌剂含量为5%或以上的抗菌纤维对S.aureus和E.coli的抗菌效果可达99%。利用激光扫描共聚焦显微镜拍摄了纤维与细菌共培养后的细菌死活情况，结果如图9所示。从图9中可知空白对照组的细菌仍大多处于存活状态，而纤维和细菌共培养18 h后，大部分细菌已经死亡，这说明纤维具有优异的抗菌性能。

图8 纤维的抗菌性能Fig.8 Antibacterial properties of fibers

图9 空白对照和纤维与细菌共培养18 h后的激光共聚焦显微镜图Fig.9 Laser scanning confocal microscope images of blank control and Cu-ZnO/PAN fiber co-cultured against bacterium after 18 h

2.3 耐水洗性能分析

图10(a)—(b)为Cu-ZnO/PAN纤维洗涤前后的细菌增殖情况，可以看出，纤维的抗菌性能并没有随着洗涤次数的增加而呈现出明显的下降趋势。图10(c)—(d)显示纤维洗涤50次后，对E.coli和S.aureus的抑菌率仍达到97%及以上，说明 Cu-ZnO/PAN 纤维具有良好的耐洗性。纤维洗涤50次后，再次观察SEM照片，结果如图11所示，可以看出，纤维仍有完整的形貌结构。通过ICP-MS测试测定纤维中的Cu含量以评价洗涤前后纤维上Cu-ZnO NPs的负载量变化，结果如表2所示。洗涤前纤维中的Cu质量分数为0.17%，洗涤后纤维中的Cu质量分数为0.14%，因Cu来源于Cu-ZnO NPs，故可得出洗涤前后纤维上Cu-ZnO NPs的负载量没有明显变化，其略微差异可能是由于离心-静电纺丝过程中Cu-ZnO NPs在PAN中的分布不均匀造成的。结合洗涤后的抑菌试验结果表明该纤维具有良好的耐洗涤性。

图10 不同洗涤次数的Cu-ZnO/PAN纤维抗菌效果Fig.10 Antibacterial images of Cu-ZnO/PAN fibers with different washing times

图11 Cu-ZnO/PAN纤维洗涤50次后的SEM照片Fig.11 SEM images of fiber after washing 50 times

表2 Cu-ZnO/PAN洗涤前后的ICP测试结果Tab.2 ICP test results of Cu-ZnO/PAN before and after washing

2.4 抗菌机理分析

金属纳米粒子表现出两种主要的抗菌机制，包括“接触杀灭”和“离子介导杀灭”。Cu2+对大肠杆菌的最低抑菌质量浓度(MIC)为4×105μg/L，对金黄色葡萄球菌的MIC为2×105μg/L。此外，Cu NPs 对大肠杆菌的MIC为2×105μg/L，而对金黄色葡萄球菌的MIC为1×105μg/L[25]。如表3和图12所示，纤维溶液振荡18 h后Cu元素质量浓度为 3 801.44 μg/L，Cu-ZnO/PAN纤维对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌没有明显的抑制区域。由于Cu离子的泄漏或Cu-ZnO/PAN纤维中Cu NPs的掉落非常有限，泄漏的Cu元素质量浓度远低于所需的Cu离子或Cu纳米粒子的MIC。因此，“离子介导的杀伤”不是Cu-ZnO/PAN纤维的主要抗菌机制。

图12 Cu-ZnO/PAN纤维的抑菌圈Fig.12 Inhibition zone images of Cu-ZnO/PAN fibers

表3 Cu-ZnO/PAN纤维振荡18 h后溶液的ICP测试结果Tab.3 ICP test results of Cu-ZnO/PAN fiber solution after 18 h′s shaking

进行电子顺磁共振自旋捕获技术(EPR)测试以检测可能的活性自由基。DMPO和TEMP被用作捕获自由基的捕获试剂[26]。如图13(a)所示，在Cu-ZnO/PAN体系中检测到强度比为1∶1∶1的TEMP-1O2信号峰，表明在Cu-ZnO/PAN体系中产生了1O2[27]。由图13(b)可知，在Cu-ZnO/PAN体系中检测到强度比为1∶1∶1∶1∶1∶1的DMPO-·O2—信号峰，表明在Cu-ZnO/PAN体系中产生了·O2—。由以上分析可知，·O2—和1O2自由基是Cu-ZnO/PAN纤维抗菌体系中的主要活性物种。Cu-ZnO NPs中的Cu(0)可以与水环境中的O2反应，形成Cu(Ⅰ)或Cu(Ⅱ)。同时，O2可能因此变成·O2—，在水环境中可以进一步转化为H2O2与H+和1O2[28]。这些产生的自由基可以穿透细菌膜，破坏细菌细胞质中的蛋白质和核酸等大分子，而这些大分子是细菌生存的重要组成部分。根据上述结果，提出了一种针对目标细菌死亡的抗菌机制，Cu-ZnO/PAN纤维产生的大量自由基作用于细菌细胞的不同部位，杀死细菌细胞。

图13 Cu-ZnO/PAN纤维的EPR图Fig.13 EPR images of Cu-ZnO/PAN fiber

3 结 论

为制备高抗菌活性的抗菌剂，本文通过简单易行的原位还原法将纳米铜负载在纳米氧化锌表面，获得抗菌活性较高的复合抗菌剂Cu-ZnO NPs，通过离心-静电纺丝技术制备得到Cu-ZnO/PAN纤维。通过表征分析研究复合抗菌剂和纤维的结构特征，并测试了其抗菌性能，主要研究结果如下：

a)复合抗菌剂Cu-ZnO NPs负载PAN纤维后，并没有明显改变PAN纤维的形貌结构；Cu-ZnO/PAN纤维通过产生·O2—和1O2自由基，自由基可以穿透细菌膜，从而杀死目标细菌。

b)抗菌性能和耐水洗性能测试结果表明，抗菌剂质量分数为5%或以上的抗菌纤维对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果可达99%，纤维洗涤50次后，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率仍达到97%及以上，说明Cu-ZnO/PAN纤维具有良好的耐洗性。