吴通奎，包涛涛，黄功明，汪忠荣，莫兴虎

黔东南州动物疫病预防控制中心，贵州凯里 556000

众所周知，病毒是一种缺乏完整细胞结构及独立完整酶系统的特殊结构，这也使得病毒不能在没有生命的培养基中单独生长，仅能依靠在活的组织细胞内生长繁殖。动物试验，鸡胚接种与细胞培养是3 种较为传统且经典常用的病毒分离方法。研究者通过以上方法分离出了很多不同种类的病毒，当然也从不同方面分别对病毒的生长周期，宿主的免疫应答等做了前期试验研究，为当代病毒学的科学研究打下了前期基础。但随着病毒变异频繁性、新发病毒的突发性及一些较难培养病毒的特殊性，使我们在研究领域遇到了很多疑难杂症，这也导致我们在病毒的深入研究中受到了一定的限制。本文分别从病毒传统的分离培养技术及近年来探索发现的一些新技术做一论述，旨在为病毒的深入研究提供一定参考依据。

1 传统的病毒分离培养技术

1.1 动物试验

动物试验是在病毒分离培养中的一种较为常用且经典的实验方法，通过使用这种方法一方面可以适用于大多病毒的分离培养和测定动物敏感范围，另一方面还能将其用于鉴定病毒和分析不同毒株之间的抗原关系等。除了以上用途外，实验动物还能用于病毒的保存和弱毒株的复壮，及生产大量的动物组织疫苗等。同种及异种动物是动物实验中所必要的两种实验动物类型，对于同种动物来说，我们在实验前应先进行血清学检查，经抗体检测合格后方能使用，以确保所选择的实验动物是合格的。小白鼠、大鼠及个体较小的猪只等是我们实验过程通常选择的异种动物类型。在我们选择动物开展试验时，要尽可能保证动物是健康的且品种是纯净的。根据病毒的特性不同，优先选用敏感性高的实验动物，尽量采取不同的接种方式进行接种。此外，在实验过程中还需考虑多做几个重复实验，以便增加试验数据的说服力。同时必须严格设立对照组，尽量避免因动物的个体差异而导致实验结果不成立。最后，在操作过程的每一环节必须保证无菌操作，若无法确定实验条件是否达到无菌状态，可将青、链霉素按要求制作成双抗混悬液，按一定比例加入至接种液中，再对实验动物进行免疫接种。

1.2 鸡胚培养

许多病毒尤其是禽源病毒几乎都能在鸡胚中进行增殖，利用鸡胚可以进行病毒分离鉴定、抗原制备及疫苗生产等。除鸡胚外，鹅胚和鸭胚也能用于个别病毒的增殖。通常应选择无病鸡群中新鲜、洁净及受精率较高的（90%以上）SPF 种蛋，以白壳蛋最佳，因其颜色单一且照蛋时也便于操作者观察。鸡胚孵化器温度一般控制在37.5 ～38 ℃，湿度控制在60%～65%左右，翻蛋频率保持在3 次/d 以上。在前期翻蛋时应先将蛋进行横放，在试验接种前2 天再改为竖放，操作过程还要特别注意鸡胚位置，以接近蛋盘中间为宜，不要过于偏向一侧。孵化过程还需进行专人管理，遇到故障时及时维修，避免造成不必要损失。接种前照蛋，应严格区分出活胚与死胚，活胚血管分支十分明显呈鲜红色，胚胎能够自由移动，死胚血管模糊不清或有时呈暗红色，我们应该选择活胚进行接种。一般选择9 ～11日龄鸡胚用于接种，某些特殊病毒则需根据其特性而选择特定日龄鸡胚。根据不同病毒增殖特点可选择不同接种方式，常见接种方式主要有绒毛尿囊膜接种，尿囊腔接种、羊膜腔及卵黄囊接种等。与此同时，我们在接种时还需保证接种环节的无菌，如通常可先在蛋壳上使用碘酒擦拭消毒3 ～5 次，然后再使用酒精进行脱碘操作，接种后的鸡胚使用石蜡进行封闭针孔。

1.3 细胞培养

细胞培养技术在病毒研究领域应用十分广泛，不仅能用作病毒的分离培养，还能用作病毒繁殖过程及细胞敏感性的相关研究。

1.3.1 原代培养

无菌采集动物组织并剪碎，先经胰酶消化获得单细胞悬液，再将其转至培养皿中培养。实践中鸡胚成纤维细胞、鸭胚成纤维细胞及犊牛睾丸细胞等均常用于不同病毒的分离。

1.3.2 二倍体细胞培养

将原代单层细胞消化分散为单个细胞悬液，继续培养传代仍为二倍体，这种细胞数量可扩大，对病毒易感性一般影响不大，从样本中分离培养病毒，通常使用这种细胞进行培养。

1.3.3 传代细胞培养

在体外培养液中可无限制分裂传代的细胞，一般来源于肿瘤组织。研究者们已成功建立了多种传代细胞系，如非洲绿猴肾细胞(Vero)、猴肾上皮样细胞(Mark-145)、猪睾丸细胞(ST)及猪肾细胞 (PK-15)等细胞系。传代细胞培养较为方便且使用也较为广泛，但其也有弊端，如对某些病毒不敏感，传代时间长及易被支原体污染或病毒隐性感染，也存在致肿瘤的潜在危险。传统细胞病毒分离方法固然有效，但是耗时长、效率低及易污染这是不可否认的。近几年，随着科学技术的快速发展，出现了很多细胞培养的改良方法，如离心培养、混合培养及转基因培养等试验技术，这些技术使得病毒分离培养在时间及效率上得到了极大程度的改善。

2 病毒分离培养新技术研究进展

2.1 “木筏式”培养

这种方式是一种将上皮细胞置于“气－液”两相介质中进行培养，就犹如木筏在空气和水面之间，故又形象地将这种培养方式称为“木筏式”培养。该方式可以使细胞高效生长并快速分化，对于接近自然状态下宿主组织的原代呼吸道上皮细胞就是一种培养模型，研究者们正是利用它能模拟出呼吸道生理环境的这种独有特点，才建立起了各种呼吸道病毒的复制及其病理机制的多种研究模型。

2.2 基质培养模型

3D 基质培养模型，是一种既能支持细胞的复制分化，又能为细胞模拟出体内生存微环境的培养体系。近年来关于基质培养模型的报道不断增加，其中人工基底膜培养体系便是其中一种。人工基底膜是一种胶状的蛋白混合物，通常可以将其用作支架，以尽可能地模拟出体内复杂的3D 细胞外环境。研究表明，使用这种模型进行培养能够很好地解决自然状态下病毒的感染和复制问题。

2.3 旋转壁式生物反应器培养模型

旋转壁式生物反应器（RWVB），一种最初由美国人设计并用于模拟太空微重力的特殊设备，具有可以精确模拟机体组织的内部环境特点。研究者们正是利用RWVB 的这种优势，将其成功改装成了一种新型的细胞培养装置。该装置是一种内部充满液体的圆柱体旋转装置，操作者可以根据细胞的种类、特性及培养物的大小对该培养装置的转速进行自动调节，以确保培养物可以在长时间内保持悬浮的状态。使用RWVB 培养的细胞具有一定空间自由度，这种自由度对细胞与细胞，细胞与基质之间的接触也是非常有利的，因为它能重现细胞极性，也能模拟出体内组织的真实环境，这些因素对于病毒与宿主之间的相互作用机制的研究也是非常重要的。此外，与传统细胞培养方式相比，由RWVB 培养的细胞对病毒具有更强的抵抗力，同时其也能产生更多的感染性病毒颗粒，病毒颗粒的增加从另一方面也表明使用RWVB 方式培养能够更好地模拟出体内环境。

2.4 干细胞来源细胞培养

对于某些培养较为困难的病毒来说，选择敏感性高的细胞做原代细胞培养通常为首选。然而采用原代细胞培养也可能会因个体差异而对实验结果产生不同影响，针对这种情况目前尚无成熟可行的评价体系，同时其培养方式是一种细胞在体外环境中单独生长，也存在不能长时间培养的局限性，这一点也是不容忽视的。当前已有很多使用干细胞来源的培养方式培养分化为相应的敏感细胞并用于病毒培养的相关报道。总的来说，与其他方法相比，干细胞来源的细胞培养在体外培养的时间可以达到更长，也能长时间的维持细胞的特异性表型，同时还能高度表达与病毒感染复制的相关因子，对于病毒与宿主之间作用的研究也非常适合。

3 小结

随着世界医学水平的快速发展，用于检测各种病毒的方法也随之不断更新，如分子生物核酸探针检测技术和免疫学方法检测技术等。分子生物学相关检测方法，因凭借其操作方便、灵敏度高等优势在疾病检测中得到了广泛应用。但一直被作为病毒鉴定“金标准”-病毒分离培养法，仍存在灵敏度低、耗时、耗力等缺点。随着生物学技术的快速发展，传统病毒分离培养的相关技术也与时俱进得到了各种新的进步，也弥补了之前的短板与不足，同时也提高了传统分离方法的实用性。而后期研究的立体细胞培养技术一方面可以提高病毒分离的效率及灵敏度，另一方面也为一些培养及分离困难的病毒提供了新的研发思路，这些技术在病毒分离、感染、病毒与宿主相互作用等方面的研究具有较好的应用前景。