石建州，何 健，刘阳坤，李 娜，陈宇婧，王国川，黄 克，姚伦广* (1.南阳师范学院 生命科学与农业工程学院，河南 南阳 473061；2.南阳师范学院 河南省畜禽保健品工程技术研究中心，河南 南阳 473061)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)首先于1921年在肯尼亚暴发，该疾病是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染猪科动物的一种烈性传染病，可感染各个品种和所有年龄段的家猪及野猪，其主要特征是病程短、高热和出血性病变，病死率高达100%，属于养猪业毁灭性疾病之一，是重点防范的一类动物疾病[1]。ASFV在20世纪中叶侵入欧洲，随后传至南美洲。在过去的十几年里，ASF流行加速，2007年基因Ⅱ型ASFV已经自东非蔓延至高加索地区、俄罗斯联邦和东欧许多国家，构成了进一步扩张的危险态势[2]。2018年8月，我国首例ASF疫情发生在辽宁[3]，随即迅速席卷全国各省。由于尚无商业化应用疫苗和抗病毒药物，因此，扑杀成为控制疫情的首选，也是遏制疫情最有效的方法，生猪养殖遭受重创，防控形势严峻。

ASFV能够长时间稳定存在于环境中，在猪科动物间高效传播。家猪、野猪和软蜱为ASFV的天然宿主[4]。ASFV是一种庞大而复杂、有囊膜的线性双链DNA病毒，属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，也是目前唯一已知的虫媒DNA病毒[5]。病毒粒子的直径为260～300 nm，具有与核质大DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDV)超家族相同的结构、基因组以及复制特性。ASFV的整体结构呈20面体立体对称形态，具有多层结构[6-7]，成熟病毒粒子包括5层结构，由内到外依次是病毒基因组(nucleoid)、内核芯壳(core shell)、内膜(inner envelope)、衣壳(caspid)和外囊膜(outer envelope)[8]。依据p72(B646L)C末端核苷酸序列差异，已鉴定出24种ASFV基因型[9]，中国、东南亚等亚洲地区以及东欧地区流行的主要是基因Ⅱ型，欧洲主要流行基因Ⅰ型和Ⅱ型。

ASFV感染周期包括吸附、内化、复制、组装和释放。ASFV具有细胞嗜性，复制主要发生在网状内皮细胞和单核-巨噬细胞中，病毒主要依赖网格蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用侵入宿主细胞，病毒内层囊膜与内体膜融合，在病毒“工厂”组装，以出芽方式释放到细胞外[10-11]。猪感染病毒后的重要特征为免疫抑制，细胞发生凋亡。病毒结构和增殖过程复杂[4]，毒株间基因组介于170～194 kb之间，含有150～167个开放阅读框，编码150～200种蛋白[12]，成熟病毒粒子中含有至少50种结构蛋白和100多种非结构蛋白，参与ASFV基因组的复制、转录、病毒组装等感染、增殖以及免疫逃逸等过程[13]，具有调控宿主细胞蛋白表达、干扰宿主天然免疫系统和逃逸适应性免疫应答等功能，能够抑制和逃避宿主的免疫，便于病毒的扩增[14]。

2020年，我国出现低致死率的ASFV基因Ⅱ型自然变异流行株，至少包括4种CD2v编码失活突变类型，病毒粒子丧失红细胞吸附性能，致病力减弱，但是存在明显的残留毒力，高剂量接种会使猪死亡或呈现亚急性、慢性临床症状，低剂量感染猪呈现持续性和慢性临床症状。ASFV水平传播能力强，潜伏期长，具有一定的隐蔽性，变异株和经典株共存共流行，较难早期诊断，监测和精准清除更加困难，给ASF防控带了更大的挑战[15]。在这种复杂的防控形势下，不仅需要制定和实施严格的预防和控制策略，也要高度重视候选疫苗的创制，接种ASF疫苗依然是防控的最好策略之一。ASFV庞大的基因组结构和复杂的免疫逃逸机制，不仅阻碍了商品化疫苗的创制，并且对疫苗的稳定性和有效性提出了严峻考验。虽然始于20世纪60年代的ASF疫苗研发均以失败告终，但是还是取得了较大的进展。本研究将对ASF传统疫苗和基因工程致弱活疫苗、病毒活载体疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗等新型疫苗的进展进行介绍，以期为ASF疫苗的研究提供参考。

1 传统疫苗

1.1 灭活疫苗传统病毒疫苗通常包括灭活疫苗和致弱疫苗。灭活疫苗是一类常规疫苗，发现一种新的病毒，一般先研制灭活疫苗[16]，具有制备技术简单，成本较低等优点[17]。灭活疫苗由灭活的病原微生物制成，通过物理或化学方法使其感染能力丧失，但免疫接种能够激活免疫系统，仍保留抗原性，一般不能刺激产生完整的细胞免疫反应[18]，这是灭活疫苗的固有缺陷。灭活疫苗是最经典的疫苗研制方式，ASF疫情流行之后，最先尝试的就是灭活疫苗的相关研究。因为体液免疫和细胞免疫在对抗ASFV感染过程中都很重要，而灭活疫苗引发先天免疫系统产生的细胞免疫水平较低，所以，很多研究通过添加佐剂刺激产生细胞免疫反应，以增强灭活疫苗的效力[19]。

灭活的抗原包括接种病毒的猪肺泡巨噬细胞、感染猪的脾组织、感染细胞的提取物、灭活纯化的病毒粒子以及感染猪的外周血白细胞上清[20]。灭活方式主要有加热、福尔马林、甲苯、甲醛、复方碘溶液、缩水甘油醛、结晶紫、乙酰氮丙啶、β-丙内酯等理化方法[21]。

由于病毒结构复杂、免疫逃避机制不清晰，以及缺失中和抗体介导的有效保护[22]，传统的灭活疫苗不能有效预防ASFV。采用不同传统方法灭活的疫苗接种能够诱导产生高效价的抗体，但难以检测出中和抗体[23]，均没有达到理想的免疫效果，不能提供有效保护，无法抵御ASFV感染。迄今为止，没有研制出满意的候选灭活疫苗。即使用灭活的ASFV全病毒辅以新型佐剂(PolygenTM或Emulsigen®-D)和制备工艺重新评估灭活疫苗，虽可检测到特异性抗体，但灭活疫苗的功效没有提高，甚至出现了抗体依赖性增强，抗体的存在可能会使病情加重，推测与病毒免疫逃逸机制或者病毒颗粒的胞内或胞外成熟方式有关[24]。现有研究数据表明，通过ASFV灭活途径制备有效候选疫苗不可行。

1.2 弱毒活疫苗灭活或亚单位疫苗难以诱导中和抗体，无法提供有效保护，理论上，弱毒活疫苗更具可行性。依据病毒致弱方法，ASF减毒活疫苗包括传统减毒活疫苗和重组减毒活疫苗。传统活疫苗包括自然弱毒株和人工传代致弱毒株2种。ASFV传统弱毒活疫苗的研究集中在分离鉴定自然致弱毒株、人工细胞(猪骨髓来源细胞、Vero细胞和COS-1细胞等)传代致弱毒株[21]。自然致弱毒株在传播流行过程中毒力下降，用其制备的疫苗使用剂量小、免疫原性好、免疫持续时间长、成本低[17]。自然致弱毒株和人工传代致弱毒株生产的弱毒疫苗都存在免疫不良反应、潜在的散毒风险、毒力返强、遗传背景模糊、生物安全隐患等众多缺陷，阻碍了ASF传统弱毒疫苗的使用。不仅生物安全是传统弱毒活疫苗的隐患，而且由于不能鉴别弱毒活疫苗免疫和野毒感染，增加ASFV净化的难度。

用自然弱毒株NH/P68或OURT88/3免疫猪，可诱导猪产生抵御同源强毒株攻击的保护作用，甚至达到100%的有效保护率[25-27]。ASFV基因Ⅱ型自然弱毒株Lv17/WB/Rie1无红细胞吸附活性，对欧亚野猪进行口服免疫，对强毒株Arm07的攻击具有92%的保护作用[28]，自然弱毒株作为疫苗使用产生发热、肺炎、流产、慢性感染甚至死亡等诸多副作用，有弱毒返强、散毒的风险[25,29]。在细胞传代培养过程中，伴随着对ASFV基因组部分区域的重大修改，包括基因的丢失和表型的改变，致使毒力减弱，丧失对母本病毒攻击的保护效力[21]。例如，随着在Vero细胞中传代培养次数的增加，Georgia株的复制能力增强，在猪原代巨噬细胞中的复制能力下降，ASFV毒力逐渐衰弱，传至第110代，毒力完全消失，获得的传代致弱毒株ASFV-G/V的抗原性改变，免疫家猪后不能诱导有效的免疫应答，无法抵御亲本病毒的攻击，推测是由基因组中多基因家族MGF360/505基因的自发缺失导致[29]。

用猪骨髓细胞传代致弱的毒株免疫猪能够使其抵抗强毒株感染，但是该弱毒株活疫苗在葡萄牙与西班牙的田间试验导致了灾难性的后果，免疫猪出现肺炎、流产以及死亡等严重的不良反应，并出现众多的病毒携带猪，在田间感染与异源强毒株并存情况下，大量的免疫猪出现慢性感染的临床症状[23,25,30]。细胞传代致弱毒株抗原性改变，无免疫保护作用[25,29,31]。病毒体外在猪原代巨噬细胞、Vero细胞、猪骨髓细胞、COS-1细胞、MS细胞中增殖、传代过程中，致病力减弱，免疫原性和稳定性也下降，难以通过传代致弱途径获得安全有效的弱毒活疫苗。传代致弱毒株的致病性是此类疫苗开发的主要阻力。

ASFV传统减毒活疫苗能够诱导体液免疫和细胞免疫，对同源病毒攻击的保护作用持续时间较长。生物安全问题是减毒活疫苗使用的隐患，可能会出现慢性感染的临床症状[31]，安全性是ASF弱毒活疫苗研究的主要内容。

2 基因工程疫苗

ASF疫苗的研制面临着巨大的挑战，至今无有效商品化疫苗可用，主要因为ASFV的多样性和结构复杂性、以及ASFV与宿主细胞互作关系、免疫逃逸机制、保护性抗原等信息缺乏。研发的基因工程疫苗，重组减毒活疫苗、病毒活载体疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗等新型疫苗具有比传统疫苗免疫效果好、安全性能高、人为设计操控性强等优势，是ASF疫苗研制的主要方向[17]。寻找合适的抗原蛋白用于新型疫苗的研究至关重要。通过基因工程获取有效的候选疫苗是最有希望的途径。通过精准删除毒力和免疫抑制基因，获得安全有效的弱毒疫苗是目前相对可行的技术路线。

2.1 基因工程减毒活疫苗致弱活疫苗诱导的免疫应答反应强烈持久，然而生物安全是潜在的风险，可以使用缺失靶向基因、重组基因等基因工程技术提高减毒活疫苗的安全性。单基因或多基因改造弱毒株或强毒株的重组减毒活疫苗已成为ASF基因工程疫苗研究的热点[32]。基因缺失疫苗最具发展潜力，通过反向遗传技术定点突变病毒基因组序列，把得到的基因缺失突变株制备成疫苗，可区分野毒感染和疫苗免疫[17]。毒力相关基因的缺失已被证明是一种有用的使毒力致弱的手段，毒力基因缺失疫苗甚至产生交叉保护[33]。

ASFV基因缺失弱毒疫苗可能是最快可以获得商品化疫苗的途径，需要解决有效性、安全性、量产等关键难点，是短期内最有希望研制成功的疫苗。构建ASFV重组减毒活疫苗应重视其生物安全性[34]，在实现病毒复制诱导免疫反应的同时，还应该避免发生病毒血症等亚临床症状，可以考虑删除病毒复制必需基因[35-36]，研发复制缺陷型疫苗[12,16]。

鉴于ASFV耐受猪可获得有效的保护性免疫反应，ASF减毒活疫苗被认为是候选疫苗[37]。重组减毒活疫苗是通过分子生物技术，靶向删除单个或多个目的基因(毒力基因、功能基因、保守区基因、免疫抑制相关基因等)以减弱病毒毒力或者增强免疫应答水平，理论上比传统减毒活疫苗更加安全有效。目前，ASF重组减毒活疫苗的研究主要集中在构建缺失强毒株或弱毒株毒力基因如UK[38]、TK[39]、9GL[40-41]和CD2v[42]、DP148R[43-44]，以及免疫逃逸相关基因如多基因家族MGF[40,45-46]、DP71L[47-48]、DP96R[49]、A238L[50]和A224L[31]。敲除毒力基因使毒株致弱。制备疫苗用于免疫接种并评价疫苗的安全性和有效性的研究发现，有的候选株能够产生针对同源毒株或异源毒株的特异性保护作用[32,51-52]，有的候选株保护效果降低或者无保护效力[39-40,49]，有的候选株具有交叉保护作用[42]，开发出商品化疫苗的可能性较大。

在通常情况下，基因缺失疫苗能诱导有效的免疫反应，保护率较高，保护效果较明显，但是安全性是相对的，残存毒力能够引起亚临床症状以及低水平病毒血症等副作用[16]，安全性是成功研发减毒疫苗亟待解决的关键问题。

近期，研究人员通过删除毒力、复制或先天免疫应答相关基因，人工把强毒株设计成为弱毒株，成功构建了1株联合缺失7个基因(MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L和CD2v)的ASF弱毒活疫苗HLJ/18-7GD，体内完全致弱，不能转化为强毒株，并对强毒株完全保护，该有效性和安全性良好的疫苗有望在控制ASF传播方面发挥积极作用[53]，是当前最具产业化前景的商品疫苗。研发的ASFV-G-ΔI177L是一种有效的抗ASF欧亚株的口鼻疫苗,通过从高致病毒株Georgia(ASFV-G)中删除基因I177L获得，对同源毒株具有较高的有效性和安全性，口鼻给药途径达到了与肌肉给药相似的效果。虽然口鼻给药的复制效率较低，但仍然诱导了全身抗体反应，保护动物免受ASFV-G的攻击。推测ASFV-G-△I177L的口鼻给药是一种可行的疫苗给药方法[54]，其安全性、有效性需进一步评价。

重组减毒活疫苗在前期试验研究中表现出了良好的保护效果，对亲本毒株能够达到100%的保护率，提供完全保护，有的也有交叉保护作用。保护力、残存毒力和持续感染力，即安全性和有效性是成为候选重组减毒活疫苗毒株的决定因素。所以鉴定合适的缺失靶基因，确定缺失靶基因的科学组合以及免疫策略和生物安全性是确保研制出既能诱导保护性免疫反应又安全可靠的疫苗的保证[23]。

疫苗的成功不仅取决于有效性、安全性，还要求能够实现量产。量产的关键在于寻找成本不高且能够进行有效复制的体外细胞系。目前，实验室常用的猪骨髓细胞(PBM)、原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)等细胞系难以实现ASF疫苗量产。近期报道了毒力致弱的HLJ/18-7GD与ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 2种基因缺失弱毒活疫苗在一定程度上实现了量产的突破。HLJ/18-7GD株在猪骨髓细胞中生长顺利，可以保持良好的免疫原性[53]；ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR是一种针对当前大流行毒株的适应细胞培养的疫苗病毒株，是第1个经过合理设计的ASF候选疫苗，解决了量产问题，可用于大规模商业疫苗生产[55]。2021年6月，弱毒疫苗HLJ/18-7GD株，已完成安全评价生产试验和第2阶段临床试验，遗传稳定，不致病、不返强，对育肥猪生长发育、增重和死淘等无不良影响；对田间商品猪存活保护率大于80%，具备量产的应用条件[56]，为ASF的防控带来曙光。

2.2 病毒活载体疫苗在预防病毒感染和清除病毒过程中，保护作用的提供依赖于抗体和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，为了获得更强的细胞免疫和体液免疫，将ASFV抗原基因重组至活病毒载体内[57]。以痘病毒、腺病毒或伪狂犬病病毒等为保护性抗原表达载体，从而激发更佳的细胞免疫和CTL应答[58]。

研究显示，在抗ASFV感染中，细胞免疫和体液免疫均不可或缺[59]。目前，ASFV活载体疫苗的研究相对较少[10]，ASFV活载体疫苗的研制主要是在诱导免疫应答方面[60]。通过选用腺病毒(adenovirus)、痘病毒(poxviuses)、伪狂犬病病毒(pseudorabies)、甲病毒(alphavirus)等载体表达ASFV保护性抗原基因(CD2v、EP153R、p72、p54、p30、p12等)进行疫苗的研制，以期激发高水平的细胞免疫和CTL反应[21]。将基因p30、p54、p72和p22重组入杆状病毒，免疫后猪体内产生中和抗体[61]，构建杆状病毒载体的BacMam-sHAPQ可诱导特异性T细胞应答，在缺乏抗体的情况下，部分猪可以抵抗同源亚致死毒株的攻击，提供部分保护[62]。

在复制缺陷型腺病毒Ad5载体中分别插入ASFV的基因B646L(p72)、CP204L(p32)、E183L(p54)和CP530R(pp62)来表达Ad-ASFV多抗原，不同剂量配制不同佐剂，采用“鸡尾酒”式混合或加强免疫策略，诱导猪机体产生良好的特异性抗体、细胞免疫应答和CTL反应[63]。将ASFV的7个抗原基因B438L、K205R、A151R、B119L、B602L、A104R和EP402R分别重组入复制缺陷型腺病毒载体，配制佐剂，实施“鸡尾酒”式混合免疫商品猪，在猪体内诱导获得了强烈的体液免疫反应以及细胞免疫应答[23]。研究证实，接种此疫苗的猪能够产生特异性抗体以及CTL反应，但不能提供完全保护作用，免疫效果均不理想，疫苗的有效性需通过攻毒保护试验进一步验证[64]。

利用HEK293细胞表达ASFV的基因p72(B646L)、p54(E183L)和 p12(O61R)，用改良的减毒牛痘病毒安卡拉(MVA)株病毒载体表达p72(B646L)、 EP153R 和CD2v(EP402R)，设计免疫策略，可诱导机体获得特异性抗体和T细胞反应[65]。

研究人员利用质粒载体和重组牛痘病毒克隆了47个ASFV基因，用DNA初免，用重组牛痘病毒加强免疫，攻毒后免疫猪出现急性临床症状，但血液与淋巴组织中的病毒水平显著下降，提示利用多种保护性抗原协同免疫能够增强疫苗的免疫保护水平[66]。

利用甲病毒载体表达ASFV抗原的复制子颗粒(RP)。构建表达p30(RP-30)、p54(RP-54)和pHA-72(RP-sHA-p72)抗原的甲病毒RPs。在Vero细胞上表达量最高以及猪体免疫原性最强的是RP-30；用减毒活病毒增强的策略可能会扩大对ASFV表位的识别[67]。

使用CRISPR/Cas9技术在伪狂犬病病毒载体中插入pE199L(E199L)、p30(CP204L)和p22(KP177R)构建病毒活载体疫苗，结果显示密码子优化后的E199L表达明显增加，嵌合CAG启动子提高了转入基因的表达[21,68]。以伪狂犬病病毒为载体构建表达CD2v和p12蛋白的重组伪狂犬病病毒，结果显示重组毒株的毒力相比野生型毒株PRV-Fa明显减弱[69]。

ASFV活载体疫苗的研制需要进一步评价多抗原疫苗的免疫原性基因以及潜在的保护性抗原基因、基因组合、免疫原性以及对实验动物的保护效力[64]。

2.3 亚单位疫苗ASF亚单位疫苗的研究思路主要是选择可诱导机体产生免疫保护作用的抗原基因，即保护性抗原，通过原核或真核表达系统表达，用得到的蛋白或多肽配以新型佐剂制备疫苗。亚单位疫苗递呈给抗原递呈细胞，诱导机体产生免疫反应，产生高滴度的抗ASFV抗体。此类疫苗只含特定的ASFV抗原，经过合适的抗原传递系统免疫动物，副作用较少，较为安全，但保护效力有待提高。ASFV编码多达150～200种蛋白，且大多蛋白功能未知，所以，筛选有效的保护性抗原有一定的挑战性。深入鉴定可以诱导强烈免疫应答的保护性抗原以及中和表位，有利于开发有效的ASFV亚单位疫苗。

前期研究表明，DNA疫苗取得了有限的成功。p30(CP204L)、p54(E183L)、p72(B646L)、pp62(CP530R)和CD2v(EP402R)等重要抗原是亚单位疫苗研发的主要靶点[70]。在感染中发挥作用的p72、p30和p54是激发体液免疫应答最重要的免疫原，p30和p54参与ASFV的吸附和内化。p72和p54的抗体可阻止ASFV的吸附，p30的抗体能阻止ASFV的内化。p72和pp62参与了病毒颗粒的组装。EP153R(C型凝集素)和CD2v蛋白是重要的预防感染的保护性抗原[71]。用p30或p54分别免疫猪，虽能够产生中和抗体，但对致死性攻毒无保护作用，病程不变。与之不同的是，用杆状病毒表达的p30和p54制备的疫苗共同免疫，可诱导猪产生中和抗体，提供部分保护作用，且能改善病程。免疫p72、p54和p30蛋白复合物，无免疫保护，但能延缓临床症状发生时间，并降低病毒血症水平。基于抗原分析，设计并合成模拟ASFV蛋白的46条多肽，分别用于接种家猪以确定其建立保护免疫应答的能力，结果证实模拟多肽片段不能提供有效保护，仅延缓死亡病程。利用反向疫苗学，系统地挑选5种ASFV抗原，以人源293(HEK)细胞表达抗原蛋白p72(B646L)、p54(E183L)和p12(O61R)以及痘苗病毒MVA为载体的3种抗原蛋白p72(B646L)、pEP153R(EP153R)和CD2v(EP402R)。采用首免-加强程序免疫猪，评价免疫效果，结果显示从HEK或MVA中表达纯化的ASFV亚单位抗原是安全的，能诱导机体产生ASFV特异性抗体，较好的体液免疫和细胞免疫水平[65]。研究疫苗保护效力本质上是对病毒毒力的评估[20]。免疫效果的评价受多种因素影响，包括疫苗类型、接种策略、目标抗原、佐剂、诱导的免疫应答；攻毒的毒株、时间、剂量、接种途径以及接种动物的遗传类别、年龄、性别等。

ASF亚单位疫苗是以目标抗原为基础的靶向方法，抗原结构蛋白众多，免疫刺激过程复杂，仅靠单一或少数几种蛋白作为抗原，即使刺激机体产生了中和抗体，也难以获得理想的免疫预防效果。因此，需要筛选鉴定出更多的免疫原性较好的保护性抗原、对抗原进行科学组合以及开发新的病毒靶点和免疫佐剂，以期更好地提高亚单位疫苗的保护力[19,23,57]。

2.4 核酸疫苗核酸疫苗即DNA疫苗，通过设计具有潜在保护性的抗原基因，将编码病毒抗原蛋白的基因克隆到表达载体，直接注射到机体，使外源基因在宿主细胞表达，不仅能够诱导宿主产生特异性的体液免疫，而且能激活细胞免疫应答，使宿主获得免疫力，实现预防与治疗的目的[19,23]。

研究人员给猪免疫了p30(CP204L)和p54(E183L)基因的真核表达质粒pCMV-PQ，未检测到诱导的免疫反应，为了提高猪的免疫应答，构建了这2个基因和猪白细胞抗原Ⅱ(swine leukocyte antigenⅡ，SLAⅡ)的特异性抗体单链可变区片段(single chain variable fragment，scFv)APCH1融合表达的新质粒pCMV-APCH1PQ，给猪接种DNA疫苗后，尽管不能提供对强毒株攻击的完全保护，但体内诱导的免疫应答增强，表明APCH1分子在DNA免疫方案中是一种良好的免疫佐剂[72]。ARGILAGUET等[73]将p30(CP204L)、p54(E18-3L)、sHA(ASFV hemagglutinin，sHA)基因与泛素的编码序列融合，构建了重组质粒 pCMV-UbsHAPQ，用其免疫后可诱导特异性T细胞应答，并有部分免疫猪抵御了强毒株的致死攻击，说明疫苗诱导的CD8+T细胞应答具有重要作用。由于少数几个ASFV抗原基因构建的DNA疫苗不能诱导高水平的免疫效果，为更多地激活CD8+T细胞潜在的免疫保护区，研究人员构建了病毒DNA表达文库，包括4 029个克隆，130 kb，约占Ba71V全基因组的76%，用其免疫后，免疫攻毒保护试验结果显示，60%的猪抵御了E75强毒株致死性攻击，虽不能提供完全的保护力，但存活的猪无排毒现象[74]，推测ASF核酸疫苗的保护力取决于保护性抗原的数量。基于ASFV是一种大型DNA病毒，编码多种蛋白，难以识别诱导保护性免疫反应的抗原蛋白，选择重组蛋白和表达ASFV基因的pcDNAs的组合联合免疫，可刺激猪体内产生IFN-γ，但无抵御强毒攻击的能力[75]。目前，研制的ASFV核酸疫苗虽能诱导高水平细胞应答，但难以抵御强毒株的攻击，推测是所用的保护性抗原不足以发挥100%的保护作用。随着深入开展ASFV未知重要抗原的筛选和鉴定，以及表达载体的改造更新，核酸疫苗作为未来开发ASF候选疫苗大有潜力[17,19,57]。

3 小结与展望

ASF大流行将继续发展，只有实施有效和安全的疫苗才能确保减少ASFV的持续传播[76]。ASF疫苗研制主要存在4个技术难题：①复杂性,蛋白数量大，有待于深入研究免疫原性和毒力基因；②安全性,活疫苗的安全性有待研究；③效力,灭活疫苗无效、蛋白疫苗无效或部分有效，如何提高保护效力；④量化生产,无合适的体外培养系统，既使疫苗安全有效，如何实现产业化生产也是一个挑战[77]。

灭活疫苗暂无开发前景。DNA疫苗和亚单位疫苗不能提供完全保护。基因缺失疫苗和致弱活疫苗能够抵御同源病毒攻击，保护良好甚至交叉保护。致弱活疫苗的研发进展突出[51]。减毒活疫苗存在毒力返强或毒力残留的安全隐患，虽然对同源毒株能够提供保护，但是对异源毒株不产生交叉保护作用[78]。至今，尚无商品化疫苗和药物，鉴于严峻的防疫压力，亟需研发安全有效的ASF疫苗[17]。ASFV的基因组庞大、免疫逃逸机制复杂，是研发ASF疫苗面临的巨大挑战。尤其是ASFV的抗原多样性(蛋白种类多、免疫抗原复杂、血清组份多样)和基因多样性(基因型、TRS/IGR插入、MGF、基因插入/缺失/突变)[79]，增大了研制有效疫苗的难度。当前，ASFV新型疫苗的研究是热点。ASFV疫苗创制需要解决的主要问题以及主要研究内容是要开展ASFV基因缺失疫苗、亚单位疫苗、多表位疫苗、活载体疫苗等新型候选疫苗研究，评价候选疫苗的安全性和有效性，创制安全、有效的ASFV疫苗，研发相应疫苗的产业化关键技术[80]。

ASF疫苗的前期研究取得了一定的成果，但还未获得可用的疫苗，对于ASFV的认知还有限，未来需要探究ASFV的生物学特性，系统深入地研究毒力基因、免疫逃逸基因、保守基因及其功能，进一步认识蛋白与功能、感染与免疫等机制，解析蛋白结构与信号通路，为研制新型疫苗和抗病毒药物提供理论依据和靶点。目前，疫苗研究的方向集中在填补免疫反应、交叉保护、安全、量产以及病毒与宿主互作机制方面的知识缺陷。生物信息学、结构学等学科的迅猛发展为ASF疫苗的开发开辟了新的途径，疫苗研发的低效试错模式将向高效科学设计模式转变[81]，突破其安全性、有效性、稳定性、量产等瓶颈，有望找到一种安全有效的疫苗，快速实现商业化[33]。