王玉凤，覃 林

(广西大学 林学院，广西森林生态与保育重点实验室，广西 南宁530004)

1 引言

森林是陆地生态系统的主要载体[1]。土壤微生物是森林生态系统的重要组成部分,而土壤细菌又是数量最多和种类最丰富的微生物群体之一[2,3]，在生态系统物质转换、能量流动和生物地球化学循环过程中扮演着不可或缺的角色，如调解植物凋落物分解和土壤养分循环等过程，对维持生态系统结构和功能稳定性方面起着重要作用[4]。

生态网络是指一种对生态系统中生物地球化学循环与能量流动进行模拟和构建的拓扑结构模型，生态网络分析则表示对生态网络进行分析归纳的方法以及研究的系统理论，也是系统生态学中一个崭新的分支学科，在20世纪70年代后期引起科研人员的注意[5，6]。近年来生态网络分析被广泛应用于生物学分析，如种群关系网络、蛋白质互作网络和基因调控网络等，已成为生态学尤其是微生物生态学新的研究热点[7]。分子生态网络是基于物种与功能水平的一种生态网络类型[8]。细菌分子生态网络则是指以细菌细胞为节点有序组合而成的生物界的一种无尺度网络，是自然生态系统中细菌及其基因组发挥功能活性的主要形式[9～11]。分子生态网络分析可以帮助我们更方便地理解一个生态系统中发挥主要作用的细菌种属，因为一个模块中相互联系的节点所对应的细菌常常是功能上紧密联系的、可以实现特定功能或者生态过程的细菌种群[12，13]。从生态学的角度系统地研究细菌群落分子生态网络,将全面真实地揭示土壤细菌群落生命活动的法则, 阐明细菌之间能量和物质传递规律,进一步挖掘和发现土壤细菌群落的潜力[14～17]。

为了更好地理解森林土壤细菌群落的构建和维持机制,本文以森林土壤细菌为重点,总结了分子生态网络的起源、构建方法及其特征，以及现阶段研究存在的问题等，旨在梳理最新研究进展和提出可能的研究途径,为深入认识森林土壤细菌群落相互作用关系的形成机制提供新的研究思路。同时，开展森林土壤细菌群落分子生态网络分析，还可以帮助我们鉴定土壤细菌群落中的关键物种，对于深入了解森林土壤细菌的生态功能具有重要作用。

2 分子生态网络分析方法

2.1 分子生态网络的起源

20世纪70年代初Hannon[18]首次将Leontief[19，20]所研发的投入-产出模型实践于自然生态系统中生物地球化学循环与能量的流动的研究[21],这时生态网络分析(Ecological Network Analysis， ENA)思想初步成形[22]。生态网络分析方法不仅可以定量分析生态网络中能量流动的数量和方向，还可以分析网络中物种之间的相互作用,从而揭示生态系统中物种种群行为的完整性与其相互作用的复杂性[23]。之后，1976年Patten[24]率先发表了生态网络分析方法的论文，同年Finn[25]在Hannon[18]的生态网络分析方法的基础上做了一些改进, 即提出了一系列量化生态系统拓扑结构的指标, 包括生态系统物质流通量、平均路径距离和模块化指数等, 这极大地改善和促进了生态网络分析方法的形成与发展。到了20世纪70年代末, 又因研究的目的性与需求性不同,生态网络分析方法分为了上升性分析以及环境元分析[26，27],分别从两个方面展开系统研究，其中上升性分析是从生态网络整体视觉来进行探究，即基于获得的信息理论来探究生态网络中物质循环与能量流动的整体表现[6],而环境元分析则从生态网络内部物种间相互作用角度来进行探讨，即分析深入至生态网络内部的物种,基于生态网络的模块成员间分布模式,从而进一步分析生态网络内部复杂的网络拓扑结构与潜在功能间的关系[28]。

分子生态网络分析(Molecular Ecological Network Analysis，MENAs)是指基于数学理论模型的一种分析方法，它可以分析复杂生态系统中生物群落内物种间的相互作用关系(协同、合作、竞争或捕食等)[7]。在物种种间与潜在功能水平上, 基于16S r RNA、18Sr RNA或ITS等扩增子测序数据以及基于随机矩阵理论(random matrix theory-RMT)，以Pearson或Spearman等相关系数的构建方法构建分子生态网络(MENs)又称为生态关联网络[29]。近年来，研究人员也将此分析方法引入到了细菌群落结构的分析，为土壤生态中的细菌群落结构分析开辟了一个新的天地。在细菌分子生态网络中, 大部分的细菌只参加一种或两种反应, 表现出一种或两种生理功能, 但少数细菌则参与多种反应,表现出多种生理功能, 形成分子生态网络的核心细菌群系[30]。因此，分子生态网络分析在细菌群落的结构构建、细菌群落之间的相互作用关系、关键种群的鉴别以及细菌对环境因素变化的响应等方面的研究中获得了一个举足轻重的地位[31～33]。近年来，分子生态网络分析已广泛应用于不同土壤类型的细菌群落研究，如农田[34,35]、草地[36]等。

2.2 分子生态网络的构建方法及其特征

目前针对分子生态网络的构建方法主要有两种。其一，在简单生态系统中是基于物种间的共现性或者相关性(相似性、相关关系、交互信息)来预测两两之间的相关关系；其二，在复杂生态系统则采用线性回归等方法来预测两个及以上的物种之间的相互作用[37]，然后利用可视化软件将预测关系进行数学转化，如CoNet[38]、Cytoscape[39]、Gephi[40]以及R 语言的igraph、WGCNA 和vegan 包[41]等，从而揭示细菌群落对生态系统功能构建、维持以及演替的影响。除此之外，所有这些分子生态网络构建方法和统计分析工具已被整合到一个全面的分子生态网络分析平台(MENAP)上，该平台是开放的(http://ieg2.ou.edu/MENA)，具体使用操作方法见图1[42]。

分子生态网络的基本拓扑性质主要包括节点、连接、平均聚类系数、平均连接度、平均路径距离、模块化指数和关键节点等信息(表1)。节点可代表现实生态系统中微生物、基因、蛋白质和环境因子等；而连接则代表它们之间的相互作用, 包括互利共生、竞争和捕食、拮抗或致死等[43～45]。细菌分子生态网络分析的主要优点有以下方面：第一，网络中能够展现位于生态系统中的细菌彼此之间的相互作用关系，进而反映细菌群落种间关系的系统特征(eco-systembiology)[46,47]，如用平均路径距离(averagepathlength)、模块化指数(modularity)、平均连接度(Average connectivity)和平均聚类系数(Averageclusteringcoefficient)等拓扑学性质参数来描述该网络的规模大小，以及网络中物质循环和能量流动的流通程度[48]；第二，网络中具有高连接度(highlyconnectednodes)的细菌通常被认为是“关键细菌”(keystonebacteria)[49,50]，这类细菌在维持细菌群落结构的整体稳定性中发挥着关键作用，如不慎丢失或失去其关键作用则会导致整个细菌分子生态网络结构解散或重组[51,52]；第三，网络的模块结构(modules)与土壤理化性质因子之间的相关性可用来指示哪些重要模块成员(细菌)具有类似生态学功能或共享生态位(niches)[16,53]；第四，网络的稳健性(robustness)大小可用来表征细菌群落分子生态网络结构的稳定性和其抗干扰性能的优劣[54～56]，稳健性大的网络结构不易因外来因素(如生态入侵、季节变化、重金属侵蚀等)所影响，进而维持所在生态系统的稳定性；第五，网络的模块特征基因(eigengene)分析可用来表征细菌群落与环境因子(如土壤理化性质因子)之间的相关性，从而判断特定细菌群落的生态学功能[49]；第六，利用分子生态网络可探究分析一个生态系统转变成另一个生态系统时细菌分子生态网络潜在功能的变化情况[57,58]。

2.3 分子生态网络分析面临的挑战

分子生态网络分析目前依然是一项新颖而又具有挑战性的任务。Faust[71]于2021年提出了当今分子生态网络建设与分析面临的十大挑战，具体如下：①分类群的相互作用是否影响细菌群落组成(Do taxon interactions influence microbial communitycomposition)？②应如何对丰度数据进行预处理(How should abundance data be preprocessed)？③如何处理稀有类群(What to do with rare taxa)？④如何处理环境因素(How to deal with environmental factors)？⑤高阶交互作用(Higher-order interactions)怎么处理(What about higher-order interactions (HOIs))?⑥如何在计算机上评估细菌网络构建(How to evaluate microbial network construction in silico)？⑦如何在生物数据上建立细菌网络构建的基准测试(How to benchmark microbial network construction on biological data)？⑧我们能从节点中学到什么(What can we learn from the hairballs)？⑨如何识别核心网络(How to identify core networks)？⑩细菌网络在多大程度上代表了生态系统(How well do microbial networks represent ecosystems)？

3 森林土壤细菌群落分子生态网络分析的现状

分子生态网络分析作为一种系统分析工具，利用其从整体上探究森林土壤细菌群落的构建和维持机制有助于更深入了解土壤发生、发展和发育的整个过程，具有不可忽视的发展前景。

Ma等[72]于2015年率先在国内将分子生态网络分析方法运用于森林土壤细菌群落的研究中，他们在我国东部地区从海南省到黑龙江省共采集了110个森林土壤，通过土壤细菌的高通量测序数据来构建分子生态网络，研究发现土壤细菌分子生态网络的拓扑特征具有明显的地带性差异，而不同细菌类群的共存关系模式也有显著差别；同时，网络拓扑特征分析表明我国北方土壤菌群共存关系更普遍，但相互影响强度却较南方土壤菌群更小；土壤有机质、铁、氮与pH值是影响分子生态网络的重要环境因素；由于细菌间相互作用比细菌多样性对土壤功能具有更大影响，这一发现为理解土壤细菌的地理分布模式及其对土壤功能的影响提供了研究新途径。该研究将系统生物学中网络的概念应用于高度复杂的环境样本是该领域发展的重要一步。其虽研究了土壤中网络拓扑特征与环境因子之间的相关性，网络中的关键物种对其他群落组成部分产生的巨大影响，但是输出的分子生态网络是统计相关性，并不直接证明细菌间的相互作用[73]。因此，未来的分子生态网络分析应侧重于更合理的推断方法，即与功能预测联系起来，对于更好地了解土壤细菌群落中的相互作用至关重要。

Wood等[57]采用分子生态网络分析方法，构建了马来西亚土壤细菌从原始雨林到油棕林(oil palm plantation)和次生林的分子生态网络，然后对其进行了比较分析，发现次生林和原始雨林之间的细菌群落分子生态网络结构存在显著差异；Tian 等[58]构建了中国东部3700 km南北向样带的原始林和次生林土壤中的细菌分子生态网络，研究发现原始林的细菌分子生态网络比次生林更复杂，即细菌在原始林中具有更大的生态位共享和更多的相互作用；Sunil 等[74]对挪威白桦林(Betula pubescens)的4个不同土壤深度(0 cm、0～5 cm、5～15 cm、15～30 cm)中细菌群落分子生态网络的研究发现，表层比底层的相关性更多，网络结构更复杂，且差异显著，表明土壤深度对细菌相互作用有重大影响；焦克等[75]研究藏东南色季拉山暗针叶林带表层(0～20 cm)和底层土壤(40～60 cm)细菌群落分子生态网络结构，发现细菌分子生态网络中正相关连接的比例均随土壤深度增加而增加，底层土壤细菌分子生态网络的平均连接度和平均聚类系数均高于表层土壤，说明细菌分子生态网络随土壤深度的增加而变得更复杂。李前等[76]在南方红壤区马尾松林下构建了 3个不同处理水土流失防治措施的土壤细菌群分子生态网络,研究表明，水土流失防治措施实施后土壤细菌群落结构发生明显变化，分子生态网络规模增大，细菌间互作强度以及细菌群落结构的稳定性提高。上述采用分子生态网络分析的研究极大地丰富了人们对各种森林土壤生态系统中细菌共生模式的理解。然而，对于细菌分子生态网络结构的差异是否对细菌功能产生影响仍然知之甚少。兰国玉等[77]以海南省典型橡胶林(rubber plantation)和热带雨林为研究对象，构建了土壤细菌群落的分子生态网络并分析其主要驱动因素，研究发现橡胶林的细菌分子生态网络结构比热带雨林简单，土壤pH值、土壤养分及季节变化是分子生态网络结构的主要驱动因素。最后，研究中还将分子生态网络分析与宏基因组测序数据结合起来构建了细菌和功能相关性网络，从而揭示了细菌组成与功能之间的相互作用。该研究为了解和管理中国与其他地方热带森林中的细菌群落提供重要借鉴，具有方法论意义。

4 森林土壤细菌群落分子生态网络分析的展望

森林土壤细菌作为森林生态系统物种丰度和多样性最高的生物之一，探究其群落构建和维持机制对于保护森林生态系统稳定性具有重要意义。然而，与宏观生态学研究相比，对土壤细菌群落分子生态网络结构的了解是有限的，且缺乏大尺度的相关研究，尤其是国内关于大尺度人工林以及自然保护区森林土壤细菌群落的报道较少。因此，亟需要在大尺度条件下对森林土壤细菌群落的分子生态网络结构开展系统的研究，以期弥补目前研究的不足和进一步完善该分析方法。结合国内外的发展前沿, 今后应重点关注以下2方面的研究:①模块化拓扑作用与特征基因网络分析相结合。在确定模块和子模块后，特征基因分析对于揭示高阶组织和基于网络拓扑识别关键群体非常重要；②分子生态网络分析与功能预测相结合。尽管分子生态网络分析具有很多优点，但毕竟只是由数学模型推断得到的，因此真实情况中所有的网络构建方法都不能区分出真正的细菌相互作用和非随机的生态过程，即使用分子生态网络分析来研究细菌相互作用带有强烈的推测性，因此需要将其和其他技术相结合应用，以获得更全面的认识。