王方圆，张奋娴，李毅，高建华，牛颜冰，申少斐

（山西农业大学生命科学学院,中兽医药现代化山西省重点实验室,太谷 030801）

近年来，微流控芯片技术越来越成熟［1～5］，由于其具有分析速度快、成本低和通量高等特点，已成为前沿技术之一，被广泛应用于各领域.微流控芯片更易模拟体内的生理环境［6～9］，在自然环境中，树叶的脉序在尺寸［10，11］、形态［12～14］和功能［15～17］等方面与人体内的血管组织类似，用树叶脉序制得的微流控芯片对研究细胞或细菌行为具有重要意义［18］.

使用自然环境中的树叶会受到季节的限制，若在树叶掉落之前没有完成实验，则实验的后续操作会受到阻碍.且每片树叶脉序的形状都不一致，制作出来的微流控芯片通道也会因树叶的不同而改变.因此，制备出仿生树叶模型具有重要意义，不仅可以解决上述问题，节约实验时间，还为实验的顺利进行提供了保障.目前，已有将微流控芯片仿生树叶模型用于生物分析方面的研究报道［12～16］.Wu等［12，13］采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）构建了树叶型微流控通道，对其生物相容性进行了研究；Mao等［14，15］利用光刻模具制作出PDMS芯片模拟了血管系统.然而，目前仿生树叶模型大多集中在PDMS芯片研究，利用仿生模型构建简单、经济、易操作的琼脂糖微流控芯片鲜见报道.

本文利用仿生树叶模板制作的琼脂糖微流控芯片对大肠杆菌的趋化性进行了研究.建立一级、二级、三级脉序，最大脉序尺寸值可达1038.02 μm，最小脉序尺寸为36.32 μm，宽度不一的通道构建为细菌趋化性实验提供了稳定可靠的梯度空间.此外，构建琼脂糖微流控芯片具有巨大优势.由于琼脂糖通道具有毛细力，琼脂糖具有亲水性，不需要借助外力就可以让细菌顺利地进入琼脂糖微流控芯片，实现对细菌趋化性的定性检测，与传统检测方法相比，可以更好地对细菌生存的微环境进行控制.琼脂糖微流控芯片相较于PDMS微流控芯片显著降低了微流控芯片的制作成本，提高了效率，可以在不伤害动物体、对环境无害的前提下，快速准确地进行药物机理、药物作用途径等方面的研究.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

新鲜桑树叶；75%（体积分数）乙醇溶液，河北康济药械有限公司；RTV615型聚二甲基硅氧烷（PDMS，A胶）和RTV615型PDMS固化剂（B胶），美国Momentive公司；三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；琼脂，B.R.级，北京索莱宝生物科技有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物，B.R.级，北京奥博星生物技术有限责任公司.

2X2-2 型真空泵和DHG型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；JA2003型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；KW-4型匀胶机（中国科学院微电子中心研究部）.

1.2 实验过程

1.2.1 仿生树叶模型阴膜的制作将采摘的新鲜树叶置于75%乙醇溶液中煮沸进行消毒处理，取出后用滤纸擦干；按m（A胶）∶m（B胶）=10∶1的比例混合制得PDMS聚合物；将树叶背面作为阳模，首先将双面胶粘在玻璃板上，然后将树叶正面贴在双面胶带上，在阳模表面覆盖一层PDMS聚合物［12，13，16］，置于真空干燥箱中抽真空完全除气泡20 min，排出气泡，确保混合溶液在密闭环境下聚合形成水凝胶，之后于恒温恒湿条件干燥，于80℃固化45 min，最后将已经固化的仿生树叶模型阴模从树叶表面撕掉，得到仿生树叶模型阴模结构.

1.2.2 仿生树叶模型的制作将1.2.1节制作的仿生树叶模型阴模用双面胶贴在培养皿的内部上方，并在阴模的正下方用培养皿承载5滴修饰液体［三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷］，密封培养皿，以上操作均在通风橱内完成，并在通风橱内静置5 h，待修饰液完全自然蒸发，从而在仿生树叶模型阴模的表面形成一层隔离层；打开培养皿，取下阴模，再次倒入PDMS聚合物，抽真空完全除气泡20 min后，放入80℃的恒温箱内12 h.修饰物的存在使得前后两次加入的PDMS相互隔离，有一道明显的隔离层，揭下即得到仿生树叶模型结构（图1）.

1.2.3 PDMS芯片的制作将按m（A胶）∶m（B胶）=20∶1比例混合的PDMS聚合物倒在玻璃板上，置于匀胶机中覆盖均匀，放入80℃烘箱3～5 min后取出，与仿生树叶模型阴模结构结合，使仿生树叶模型阴模与玻璃板紧紧键合，即得到PDMS芯片.

1.2.4 琼脂糖芯片的制作图2为微流体芯片设计图，芯片主要由加工有微流体通道的琼脂糖薄层和玻璃基底组成.将融化的琼脂糖倒在PDMS仿生树叶模型阳模上，待冷却凝固后，在揭起琼脂糖芯片前将通道开口阵列切开［19］；将清洗干净的琼脂糖芯片和玻璃基底紧密贴合.

Fig.1 Production process of bionic leaf modela.Natural leaves are pasted on double-sided tape；b.PDMS prepolymer is poured into the glass plate；c.PDMS replica is stripped after curing；d.PDMS is decorated；e.PDMS prepolymer is poured into the culture plate；f.PDMS replica is stripped after curing.

Fig.2 Production process of agarose chipa.Agar is poured;b.PDMS replica stripped after curing;c.the channel opening array is cut;d.agar replicates are bonded to the substrate.

1.2.5 菌液样品的制备在超净工作台中吸取少量菌液加入含液体LB培养基（含氨苄）的EP管中，混合均匀后，再抽取少量菌液均匀地涂布于固体LB培养基（含氨苄）平板上.然后，将接种后的培养基置于37℃恒温培养箱中过夜培养，在超净工作台中挑选单菌落，将单菌落放入含LB培养基（含氨苄）的EP管中.将挑完单克隆的菌液放入37℃培养箱中振荡培养3～4 h后，取出放入4℃冰箱中贮存待用.实验前，在超净工作台中取储存在EP管中的菌液到含氨苄的LB培养基中，再振荡培养20 h待用.GFP转导的大肠杆菌（E.coli）由山西农业大学生命学院高建华副教授提供.

1.2.6 大肠杆菌趋化性观察用琼脂糖微流控芯片培养并观察大肠杆菌的运动状况.将细菌悬液样品加样于琼脂糖微流控芯片的入口处.由于毛细现象［19］，细菌悬液样品会被动地流入微通道内.为对大肠杆菌的趋化性进行观察，可在适当时间点在入口处分别滴加PBS缓冲液和含氨苄的LB培养基.

2 结果与讨论

2.1 芯片材质的选择

制作了PDMS微流控芯片和琼脂糖微流控芯片.通过对比2种材质芯片的效果，后续实验采用琼脂糖微流控芯片.原因如下：（1）由于用PDMS制作的仿生树叶模型尺寸较大，阴模结构靠近中心位置和其它边缘位置的承重力存在差异，导致阴模结构与玻璃基底上的PDMS聚合物键合在一起时，容易出现贴合不均匀的现象，进而在自身重力作用下出现管道塌陷，如图3所示；而琼脂糖芯片只与玻璃基底结合，无其它物质堵塞通道结构，且通过后续用染料和荧光显微镜下的观察验证了各通道结构均正常存在.（2）PDMS的成本远高于琼脂.（3）PDMS微流控芯片的制作时间要比琼脂糖微流控芯片长很多.琼脂糖微流控芯片可以实现对细菌趋化性的定性检测，与传统检测方法相比，可以更好地对细菌生存的微环境进行控制［20］.综上所述，最终实验采用琼脂糖微流控芯片.

Fig.3 PDMS microfluidic chip

2.2 琼脂糖微流控芯片通道结构的验证

琼脂糖是亲水性物质，所以样品中的水分可以透过琼脂糖层，利用这一性质可以验证用仿生树叶模型制作出来的琼脂糖微流控芯片各结构通道是否正常存在.将用乙醇制备的蓝色染料滴加在琼脂糖微流控芯片的入口处，几秒钟之内蓝色染料分布于整个结构中，显现出一个完整树叶形状，如图4所示，表明制得的琼脂糖微流控芯片各结构通道都正常存在.

Fig.4 Dyed agarose microfluidic chip

Fig.5 Schematic diagram of mulberry leaves and their pulse sequence

植物叶脉指的是叶片表面可见的纹络，主要由贯穿在叶片内部的维管组织及其周围的薄壁组织、厚壁组织和厚角组织等组成，叶脉通过叶柄与茎内的维管组织相连，起输导和支持作用［21］.叶脉在叶片上呈现出各种有规律的脉纹分布，称为脉序.脉序可分为3类：平行脉、网状脉和叉状脉.本文中后续实验主要采用桑叶，但对叉状脉的银杏叶，平行脉的车前子叶、玉兰叶，网状脉的桑树叶，毛泡桐叶都进行了制作，均可做出仿生树叶模板.本实验用到所有叶片主要为网状脉，网状脉序作为水分的运输通道，能够为叶肉细胞提供持续稳定的水分供给［22～25］，这是因为网状结构为水分输送提供了多条路径［26，27］.脉序又分为一级脉序、二级脉序和三级脉（图5）.实验结果表明，本文所构建的仿生琼脂糖微流控芯片具有以上3种脉序.

Fig.6 Distributions of Escherichia coli in various channel structures

此外，将大肠杆菌菌液注入琼脂糖微流控芯片中，在荧光倒置显微镜下观察了各通道结构（图6）.并对所构建的仿生模型通道尺寸进行统计，一级脉序1条，尺寸最大值为1038.02 μm；二级脉序8条，尺寸最大值为335.07 μm，尺寸最小值为97.08 μm，大部分二级脉序的尺寸在200～280 μm之间；三级脉序76条，尺寸最大值为114.88 μm，尺寸最小值为36.32 μm，大部分三级脉序的尺寸在50～100 μm之间.所构建的仿生模型通道宽度不一，更接近于人体的真实环境，大肠杆菌能够顺利进入各级脉序，产生梯度的分布.这些现象证明已构建出仿生树叶的琼脂糖微流控芯片，为后续研究大肠杆菌的趋化性奠定了基础.

2.3 大肠杆菌的趋化性

在自然环境中，适合细菌生长繁殖的场所都有一定的离子浓度和营养成分，细菌能够感受周围环境中的化学物质，并沿着化学物质的浓度梯度定向运动，这种性质称为趋化性［28］.为验证所构建的仿生树叶模型制作出的琼脂糖微流控芯片可以用于研究大肠杆菌的趋利性，设置了蒸馏水和培养液两种不同生存环境的对照组.因芯片中的各结构通道高度、宽度不一，所以当把菌液滴在入口处时会出现毛细现象，将菌液吸入.由于毛细现象，所用大肠杆菌分布于各通道中，会优先向生存空间充足的地方移动，即菌液会即刻把一级脉序、二级脉序充满，之后再从二级脉序缓慢地移向三级脉序.芯片的入口只有一级脉序，细菌样品首先接触到一级脉序，接着在毛细现象的作用下逐渐接触到其它脉序.从视频S1（见本文支持信息）可以看出，若在入口处滴加几滴PBS缓冲溶液，毛细现象会使PBS缓冲溶液被吸入通道中，PBS缓冲溶液与菌液之间具有一段空结构通道，形成一段压力柱，大肠杆菌会加快向原方向移动速度，且一段时间后也并未向入口处移动［图7（A）和（B）］.

Fig.7 Movement of bacterial solution away from the inlet every 5 s in the channel structures after adding bacterial solution(A)or PBS solution(B)at the inlet and the movement of bacterial solution near the inlet every 5 s in the structural channel after adding the culture solution at the inlet(C)

图7（C）所示为相同条件下，把菌液（1.5×108个/mL）滴在入口处，所用大肠杆菌分布于各通道中，此时在入口处滴加一滴含氨苄的LB培养液，大肠杆菌则会向相反方向移动，即向滴加培养液的入口处方向移动，视频S2（见本文支持信息）可以印证这一现象.对各种溶液进入芯片后的移动距离进行了统计，若规定远离入口处的方向为正向，加入菌液后15 s正向移动了6.95×102μm，加入PBS缓冲溶液后15 s正向移动了7.03×102μm，加入营养液后15 s反向移动了1.39×103μm.以上结果说明，在周围生活环境所提供营养物质相同时，大肠杆菌会顺着所受外界力的方向移动，但是如果有更好的生活环境，大肠杆菌受到的外界力会远小于大肠杆菌向更好生活环境移动的力.大肠杆菌的运动性包括游动和群集运动，它们受鞭毛的逆时针旋转和顺时针旋转调节，通常使用复杂的趋化信号系统来指导它们的运动.相关蛋白协调合作，相互影响，感知环境中化学物质浓度的变化，并将这些化学信号转化为细胞内信号，控制相关蛋白的表达，进而控制鞭毛运动，促进大肠杆菌向更好的生活环境移动.

3 结论

利用PDMS和三氯硅烷的特性制作了仿生树叶模板，并进一步构建了可进行细菌培养和观察的琼脂糖微流控芯片.仿生树叶模板的制作使实验的进行不受季节限制，可节约成本，保护环境.最重要的是由于脉序的高度、宽度、长度不一，为细菌趋化性实验提供了稳定可靠的梯度空间，对探索药物筛选、微生物利害等研究具有重要意义.此外，琼脂糖微流控芯片平台的建立有利于对细菌的培养和观察，植物和动物的内部运输通道虽然大相径庭，但是在血管网络结构方面非常相似，在一定程度上可以模拟血管的相关生理学特性，用于研究多种血细胞相互作用的机制和多种药物对心肌细胞影响等.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20220445.