黄业伦 刘欣 黄艳君 陈剑锋 谢伟胜 罗少珍 刘志辉

广州市胸科医院检验科，广州 510095

通信作者：刘志辉，Email：liuyixi2005@163.com

临床标本涂片显微镜检查找抗酸菌在结核病诊断中虽然灵敏度不高，但为简便快速、经济实用的实验方法，与此同时也是指示结核病患者传染性强弱、考察抗结核化疗效果与治疗转归、评价结核病控制效果的重要指标，目前尚无任何实验诊断技术能取而代之［1-4］。涂片显微镜检查找抗酸菌虽然技术不高深、方法也很简单，但主观性强，人为因素影响较大，刘志辉等［5］1995—2000 年3.3%的假阴性实验室内质量控制结果即深刻说明了这一点。随着电子计算机技术、信息化技术、神经网络技术等的飞速发展，显微镜检查找抗酸菌检测已逐步向全自动制片、染色和镜检方向发展，基于抗酸染色或荧光染色检测抗酸菌的显微扫描仪已走进临床实验室，其效果如何目前我们尚未查见相关文献报道，现将我们2019 年12 月至2020 年6 月进行的人、机检测对比分析结果报道如下。

资料与方法

1、一般资料

采用试验研究方法对比分析在广州市胸科医院检验科2019 年12 月至2020 年6 月的5 284 张金胺O 荧光染色涂片中进行研究。

2、仪器与试剂

结核分枝杆菌显微扫描系统FS400 宁波舜宇仪器有限公司，金胺O 荧光染色试剂由实验室自行配制，涂片采用与显微扫描仪配套的载玻片。

3、金胺O荧光染色试剂配制

3.1、染色剂（金胺O 染液） 称量金胺O 染液1 g，使之完全溶解在95%乙醇100 ml 中，另取50 ml 石碳酸液加在850 ml蒸馏水中，将此二液混合均匀（不必过滤），装入褐色瓶中，放室温保存。

3.2、脱色剂（3%～5%的盐酸乙醇） 3 ml（或5 ml）35%浓盐酸与97 ml（或95 ml）95%乙醇混合。

3.3、复染剂（0.5%高锰酸钾水溶液） 称量5 g 高锰酸钾，加入1 000 ml蒸镏水中摇匀。

4、实验方法

包括标本收集、涂片、染色、镜检（人工镜检或显微扫描检测）、结果报告5 大步骤，实验操作参照《结核病实验室检验规程》［6］和结核分枝杆菌显微扫描系统FS400操作说明书进行。其中，显微扫描检测的主要操作如下：检查和启动仪器、打开软件，将染色好的玻片放在玻片架上（每架40 张）并置入仪器，点击标准扫描，扫描速度5～7 min∕张。

5、显微扫描结果人工复检抽样和显微镜检

对所有仪器报告阳性涂片、约15%的仪器报告阴性涂片（随机抽取）进行人工复检，计算其假阳性率和假阴性率；对假阴性者，应用显微镜玻片夹坐标尺标注人工复检到的抗酸菌在涂片中所在位置，估计其在仪器扫描区域内外的情况。

6、统计学方法

采用分类资料的统计描述方法手工计算显微扫描系统检测结果的假阳性率和假阴性率，人工复检查见抗酸菌在仪器扫描区域内、外的发生率。

结 果

1、显微扫描仪器系统假阳性与假阴性结果情况

在5 284张涂片中，仪器报告阳性1 290例，人工复检报告阳性850例，假阳性率为34.11%（440∕1 290），这些涂片在显微镜下可观察到短杆、散在点粒、杂质等荧光染色物；随机抽查仪器报告阴性涂片665 张，人工复检报告阳性100 例，假阴性率为15.04%，假阴性结果包括38 例±、50 例1+、6例2+、4例3+、2例4+。

2、仪器系统假阴性涂片人工复检结果

⑴随机抽查仪器报告阴性涂片665 例，人工复检发现100 例假阴性涂片，镜检分级结果为±、1+、2+、3+、4+的 假 阴 性 率 分 别 为5.71%（38∕665）、7.52%（50∕665）、0.90%（6∕665）、0.60%（4∕665）、0.30%（2∕665）。⑵对于人工复检分级结果为±、1+、2+、3+、4+的100例假阴性涂片，其落入到仪器阅片区域内和外的例数分别为11 和27、23 和27、3和3、3和1、2和0。

讨 论

在涂片中见到的抗酸菌包括结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTC）、麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌（non-tuberculous Mycobacterium，NTM），而麻风病在我国已基本消除，故能想见各类临床样本中的抗酸菌主要为MTC 和NTM。对于NTM，目前全世界已经发现190余种并且不断有新种发现，我国则分离到60余种，其引起疾病的发病率和患病率也有逐步增加的趋势［7-9］。在实验检测中，广州市胸科医院结核病防治所实验室1994—2003 年的NTM 分离率为6.28%［10］、住院部实验室1998—2001 年的NTM 分离率为16.50%［11］，2012—2016 年广州市越秀和海珠两老城区的NTM 分离率为4.18%［12］；Zhou 等［13］的meta 分析则报道2000—2019 年间我国结核病疑似病例中NTM的粗分离率为4.66%～5.78%，NTM在所有分枝杆菌分离株中所占的比例为11.57%。由此可以推断在涂片查找的抗酸菌中有10%左右的NTM。我们在光学显微镜下可以看到不同种类的分枝杆菌形态各异，结核分枝杆菌也分杆菌型、球菌型、颗粒型、滤过型4 种类型，单个散在时或呈人型、V 型、T 型、Y 型，多个细菌扭集在一起时可呈绳索状、束状或丛状［14］，在人工显微镜检判断时即存在一定程度的主观性。显微扫描系统检测抗酸菌属于人工智能，其常用方法和模型包括人工神经网络、深度神经网络、卷积神经网络和循环神经网络，如何准确识别形态多样的抗酸菌，则更有赖于机器深度学习中训练数据的质与量，深度学习依赖于大量的标注数据，而标注数据的质量决定着深度学习模型训练的结果［15］。李强等［16］评价了自动显微镜扫描系统的效果与人工镜检的阳性率相近，但两者间的差异性没有在形态学和扫描区域方面进行分析。在本文的分析结果中，显微扫描系统检测抗酸菌的假阳性率为34.11%，在人工复检时也能看到涂片中短杆、散在点粒、杂质等荧光染色物，充分说明机器深度学习中训练数据的质与量还相当不足，我们必须建立数量更多、质量更高的数据库供仪器系统深度学习，以提高仪器系统的建模质量，不断降低其假阳性情况的发生。哈艳等［17］应用增强图卷积神经网络对透射电子显微镜病毒图像特征的识别的研究理念值得我们借鉴。与此同时，更需强调的是：对显微扫描系统检测阳性结果必须全部人工复检，因为在临床中抗酸菌检测阳性即几近确诊为结核病（因为已于前述NTM 仅占10%左右），假阳性结果严重影响患者的临床治疗，只有当显微扫描系统检测与人工复检结果达到高度一致时方可考虑适度降低对这一程序的要求，如按比例抽查人工复检等。

显微扫描系统检测抗酸菌在高假阳性结果的同时，我们也得到了15.04%的假阴性结果，可以看到其原因有二：一是仪器系统对阅片域内的抗酸菌“认不清”，属仪器系统建模质量问题；二是仪器系统对阅片域外的抗酸菌“看不到”，为仪器系统扫描区域设置问题。涂片染色查找抗酸菌灵敏度本来不高，如何提高是人们一直都在探讨的课题，因此如何减少显微扫描系统检测抗酸菌假阴性结果，也是我们必须重视的问题，提高仪器系统建模质量、扩大仪器系统的扫描区域是解决问题的基本途径。如何提高仪器系统建模质量已于上述，至于扫描区域如何扩大，则需兼顾检测速度，大家在实践中应予务实探索，结合样本临床信息对显微扫描检测阴性涂片进行适当比例的人工复检可以在相当程度上弥补仪器系统的缺陷。

总之，高质量维护显微扫描系统建模数据库是仪器系统应用中的常态性工作，必须持之以恒；依据仪器系统检测结果进行人工复检，是保证检验正确的必要手段，必须常抓不懈。

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