谭拥军 裴超柱 程浩杰 卜会铜 谭桂湘 邓磊

摘要：通过去溶剂化方法，将单体抗肿瘤多肽M1-21纳米化，形成50 nm左右大小的多肽纳米颗粒（Nano-M1-21）.运用动态光色散技术（DLS）和低压透射电镜（TEM）对Nano-M1- 21进行表征，并进行体外37℃条件下颗粒稳定性测试，运用乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7和4T1细胞验证Nano-M1-21的抗肿瘤效果，结果表明Nano-M1-21更容易被细胞摄取；相比单体多肽，达到抑制肿瘤细胞的浓度更低.运用小鼠乳腺癌4T1细胞活体肿瘤移植模型，发现Nano-M1-21展示出良好的抑瘤效果.总之，单体肽M1-21经纳米剂型优化后，有利于改善细胞的摄取，显示出更好的抑瘤效果.

关键词：M1-21；Nano-M1-21；纳米化；抑瘤效果；多肽

中图分类号：Q784文献标志码：A

Desolution Optimization of Anti-tumor Peptide M1-21

TAN Yongjun，PEI Chaozhu，CHENG Haojie，BU Huitong，TAN Guixiang，DENG Lei

（College of Biology，Hunan University，Changsha 410082，China）

Abstract：The anti-tumor peptide M1-21 monomer was used to create nanoparticles（Nano-M1-21，about 50 nm）by the desolution method. The characteristics of Nano-M1-21 were determined by the dynamic optical dispersion （DLS）and the low pressure transmission electron microscopy （TEM）. The stability of Nano-M1-21 particles was measured in vitro at 37 degrees centigrade. To verify the anti-tumor effects of Nano-M1-21，we used breast cancer MDA-MB-231，MCF-7 and 4T1 cells to show that Nano-M1-21 was easily absorbed by the cells and its tumor inhibitory concentration was lower than that of monomer peptide. With a mouse breast cancer 4T1 cell-grafting tumor model，we found that Nano-M1-21 showed a good suppressive effect on the tumors. In conclusion，compared to the monomer peptide M1-21，the optimized Nano-M1-21 nanoparticles provide benefits to improve the cellular uptake and anti-tumor effects.

Key words：M1-21；Nano-M 1-21；nanoization；antitumor effect；peptides

自1920年胰島素疗法问世以来，多肽药物以持续稳定的速度进入临床开发[1].天然多肽由于较差的化学和物理稳定性以及较短的血浆半衰期，通常不适合直接用于治疗，已经利用许多化学的修饰的方法，或增强肽的二级结构（即折叠）来防止被蛋白水解酶降解，从而改善多肽药物的体内半衰期[2-5].

多肽可自组装成不同的结构，包括纳米管、纳米球、纳米线和纳米纤维[6].这些有序纳米结构的形成与各种分子间非共价相互作用的协同效应有关，包括氢键、π-π堆积、静电、疏水和范德华相互作用[7].自组装球形肽（NPs）直径小于100 nm，由于易被细胞吸收特别适合生物医学应用.NPs还可以在自组装过程中将疏水性药物加载到其内核中，从而使其成为药物递送系统的理想候选药物[8-9].较小的颗粒（<100 nm）避免被网状内皮系统（RES）立即清除，而较大的颗粒（>250 nm）通过吞噬作用和肾脏的天然过滤系统迅速清除[10].肿瘤血管系统的高渗透性允许大分子和纳米颗粒进入肿瘤间质空间，这种自发性积累或“被动”靶向作用被称为增强的通透性和保留（EPR）效应，EPR效应介导的药物递送目前被认为是将药物引入肿瘤的有效方法，特别是大分子药物和载有药物的药物纳米载体[11-12].

本课题组筛选出了一种来源于FOXM1的抗肿瘤多肽M1-21（专利号：CN108440671B），已经展现出抗肿瘤效果[13]，具体的药理机制已经完成正在投稿中.我们通过去溶剂化的方式，使抗肿瘤多肽M1- 21自组装形成一定大小的纳米颗粒，增强了多肽的二级结构，不易被水解酶快速降解，并且Nano-M1- 21可通过EPR效应在肿瘤组织部位富集，更好地发挥抗肿瘤的效果.

1材料与方法

1.1材料

二氯树脂、氨基酸购于希施生物科技有限公司，DMF、PIP、DIEA、HBTU、DCM、TFA、EDT、YIS、无水乙酷、乙腈（色谱级）、无水乙醇、甲醇、异丙醇、吡啶等购于国药集团化学试剂有限公司，DMEM培养基购于GIBCO公司，胎牛血清（FBS）为Hyclone公司产品，乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、4T1细胞购自TACC，台盼蓝、FITC、BCA试剂盒购自生工生物工程有限公司，balb/c小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司.

1.2方法

1.2.1设置程序进行多肽M1-21的合成以及纯化、鉴定、标记

利用全自动多肽合成仪合成多肽M1-21[图2（a）]，合成的多肽粗品在蛋白纯化仪上使用C18柱反向层析进行纯化，流动相分别是水（0.05%TFA）和乙月青（0.05%TFA），乙月青上升洗脱.先对纯化出的多肽進行质谱定性分析，再用高效液相色谱仪对纯化的多肽M1-21进行纯度检测，采用C18柱反向层析进行，流动相分别是水（0.05%TFA）和乙腈（0.05%TFA），乙腈上升洗脱，最后软件积分求出峰面积百分比.用过量摩尔比的FITC对多肽进行标记，FITC粉末溶于Py：DMF：DCM=12：7：5的混合溶液中，再与连有多肽的二氯树脂混合反应6h，反应结束后用DMF、异丙醇、DCM，先后各洗两遍，再用切割液将标记好的多肽切割下来，用9倍体积乙醚进行沉淀，冻干.

1.2.2单体M1-21去溶剂化形成Nano-M1-21及表征

10 mg的多肽M1-21溶于1 mL的1*PBS中，取100 μL于反应瓶中，置于磁力加热搅拌器上（600 r/min，25 ℃）搅拌，以1 mL/min的流速加入4倍体积的无水乙醇，持续搅拌20 min，18 000 g离心收集沉淀，用PBS清洗沉淀，去上清，再用PBS超声重悬Nano- M1-21.最后用BCA试剂盒测量Nano-M1-21的浓度（图1）.动态光色散（DLS）仪测量纳米颗粒流体动力学直径及其分布.取10 μL乙酸铀染色的Nano-M1-21悬浮液滴吸附在碳涂层的300目铜网上5 min，然后用滤纸除去残留的液体，干燥，再进行TEM观察.

1.2.3Nano-M1-21细胞水平效果验证

将MCF-7、MDA-MB-231、4T1乳腺癌细胞铺到24孔板中，待细胞贴壁后，按10 μM、20 μM、30 μM、40 μM、50 μM的浓度分别加入M1-21、Nano-M1- 21，36h后去上清加入0.04%的台盼蓝溶液处理3～5 min，去除台盼蓝溶液并用PBS清洗两遍，显微镜下拍照，再进行活细胞计数.按照上述方法，将FITC标记的M1-21与未标记的多肽按1：9的比例混合制备带荧光的Nano-M1-21，按照前面相同的方法测量浓度以及表征.再按30μM的浓度加入到MCF-7，MDA-MB-231乳腺癌细胞中处理2 h，然后观察荧光判断M1-21、Nano-M1-21进入细胞的情况.

1.2.4Nano-M1-21动物水平效果验证

状态较好的balb/c小鼠，年龄达到6周后，皮下接种5×10个4T1乳腺癌细胞建立皮下实体瘤模型.3 d 后，M1-21，Nano-M1-21分别以25 mg/kg的剂量尾静脉给药，隔天给药一次，并对小鼠体重和肿瘤大小进行测量.

2结果

2.1多肽M1-21的合成与鉴定

为了检测多肽合成的质量，我们通过质谱分析多肽M1-21［图2（a）］，质谱结果显示［图2（b）］在3560处有明显峰图，与M1-21相对分子质量一致，说明多肽M1-21合成成功，并且高效液相色谱检测纯化后的M1-21浓度高达96.161%［图2（c）］.

2.2Nano-M1-21的制备与表征

单体多肽M1-21通过去溶剂化自组装形成纳米颗粒（图1），TEM和DLS的结果显示纳米颗粒大小均匀地分布在50 nm左右［图3（a）（b）］.体外37 ℃稳定性测试（DLS检测）可知，24h后纳米颗粒的大小主要分布在45 nm左右，48 h后大小主要分布在27 nm 左右，8 d后纳米颗粒大小一直维持在27 nm左右［图3（c）］，说明纳米颗粒在37 ℃下具有比较好的稳定性，不会完全解聚为单体.

2.3细胞水平上Nano-M1-21能更好地抑制肿瘤细胞的活力

为了验证Nano-M1-21的效果，在MDA-MB- 231、MCF-7、4T1乳腺癌细胞中，将M1-21和Nano- M1-21按浓度梯度分别加入这三种肿瘤细胞中，36 h后，用台盼蓝染色后活细胞计数发现，Nano-M1-21达到和M1-21单体多肽相同的效果所需的量更少. 在MDA-MB-231，MCF-7和4T1细胞中，相对于M1- 21，Nano-M1-21的IC50分别减少1.53倍、3.37倍以及1.5倍（见图4）.

2.4Nano-M1-21更易于被细胞吸收

按照前面去溶剂的方法，将FITC标记的M1-21和未标记的M1-21按1：9混合制备了带荧光的Nano-M1-21，DLS和TEM表征发现，颗粒大小均匀分布在50 nm左右［图5（a）（b）］.在MDA-MB-231、MCF-7乳腺癌细胞中，荧光图[图5（c）（d）]乳可知Nano-M1-21更易于被细胞吸收，可能由于纳米化后改变了细胞对M1-21的摄取方式，明场细胞图发现Nano-M1-21组的细胞形态发生了明显改变.

2.5Nano-M1-21明显抑制balb/c荷瘤小鼠肿瘤的生长

在balb/c小鼠皮下实体瘤模型中，通过隔天尾静脉给药进行治疗，给药过程中[图6（a）]，小鼠体重没有发生明显变化[图6（b）]，Nano-M1-21比起M1-21 单体肽展现出更好的抑瘤效果[图6（c）]，治疗结束后，将小鼠处死，取出每组皮下瘤观察大小[图6（d）]并称量瘤子的质量[图6（e）]，这些结果都表明，在小鼠肿瘤模型中Nano-M1-21有更好的抑瘤效果.

3讨论

肽类药物给药后可能受到蛋白水解酶降解或诱导免疫反应而受到限制，所以将多肽充分递送至肿瘤部位是具有挑战性的[14].因此，部分肽类药物需要改进其递送方式以成功开发出抗癌肽.药物递送研究的基本目标是通过改善治疗分子的递送来提高治疗分子的功效.制剂、控释、递送途径和保存期限的改进大大提高了治疗效果[15-19].纳米颗粒已被用于改善小分子抗癌药（例如阿霉素和紫杉醇）的药代动力学特性和治疗效果[20].通过这种方式，纳米颗粒具有通过增强渗透和保留（EPR）效应在肿瘤微环境中维持药物暴露的能力[21].另外，可以用与肿瘤细胞表面特异性的靶标结合的配体来修饰纳米颗粒[22]，从而达到抗癌药物靶向肿瘤治疗的效果.

因此，我们在具有抗肿瘤效果的多肽M1-21的基础上，通过去溶剂化的方式，使单体多肽分子间在疏水力的相互作用下自组装形成50 nm左右的多肽纳米颗粒.纳米化后，细胞对颗粒物质进行胞吞，纳米颗粒的大小会影响它与细胞膜的相互作用，并最终影响细胞内吸收，直径约50 nm的纳米颗粒通常更容易被细胞吸收[23]，因此M1-21单体多肽通过纳米化后易于被细胞吸收，改善了多肽对于肿瘤的抑制效果.而自组装方法可用于治疗性肽药物的剂型改造，以改善其稳定性和治疗活性，从而开发无载体的药物递送系统.在本次研究中，Nano-M1-21在小鼠肿瘤模型中取得了比较好的抗肿瘤活性，但Nano-M1-21通过EPR效应在肿瘤部位的富集以及延长其代谢周期还需进一步验证.除了通过M1-21本身自组装形成纳米颗粒完成递送外，还可尝试其他可自组装的两亲性材料（脂质体等）来完成多肽M1-21的递送，这两种方法往往只是EPR效应的被动靶向.想要取得更好的靶向效果，可以考虑采用主动靶向的策略，在纳米粒子表面直接修饰与肿瘤细胞表达的受体定向结合的配体（iRGD）来靶向肿瘤细胞.因此，多肽M1-21可尝试结合被动靶向和主动靶向的优化策略，达到更好的抑瘤效果.

最后，多肽在自组装过程中可将疏水性药物（紫杉醇，阿霉素）载入其疏水内核[9]，那么我们的多肽M1-21成为药物递送系统的理想候选药物的同时也可联合其他药物共同治疗肿瘤.一种重组蛋白（四聚体M2e）可通过去溶剂化先形成纳米粒子核心，然后在其表面交联抗原肽（HA），这种纳米颗粒疫苗可诱导持久且强大的免疫力[24]，所以Nano-M1-21可成为有效抗原的载体，进入体内关键区域诱导免疫反应.

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