彭丽琪，姚昆鹏，蔡虎志，唐燕萍，刘越美，陈青扬，陈新宇

(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

迄今为止，由新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引发的新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎)已成为全球范围内的疫情大流行，世界卫生组织宣布新冠肺炎疫情为“国际关注的突发公共卫生事件”。截至2021年3月，全球已有超过1.2亿人感染SARS-CoV-2，共计270万余人死于新冠肺炎[1]，对人类生命健康构成巨大威胁。SARS-CoV-2具有人群易感性，主要经呼吸道飞沫和密切接触传播。机体感染SARS-CoV-2后表现为发热、干咳等，重症病情进展迅速，甚至引发器官组织的急性损伤、变性及坏死，预后极差。

为充分发挥湖湘中医药在疫情防控中的作用，湖南省中医药管理局组织国医大师熊继柏、新冠肺炎疫情防控省级中医医疗救治专家组组长陈新宇等专家，结合湖南省地域及气候特点，研究制定了“成人预防方”和“儿童预防方”。目前，预防方已在全省机关、企事业单位、学校等范围内得到全面推广，用于抗疫前线和隔离、密切接触人群的疾病预防，发挥出良好的防治效果。《湖南省新冠肺炎疫情防控中医药诊疗方案(2021年第二版)》的“儿童预防方”由黄芪、苏叶、白术、防风、甘草、芦根、薏苡仁和连翘组成，具有益气固表、祛湿却病、运脾开胃的功效，能提升人体正气，增强御邪抗病能力。本研究旨在通过网络药理学方法预测“儿童预防方”防治COVID-19的活性成分、关键靶点，分析其潜在作用机制，为今后疫情防控和新药研发提供基础。

1 材料与方法

1.1 筛选药物和COVID-19疾病靶点通过检索TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php)和ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)数据库，依据“OB≥30%，DL≥0.18”和“Score cutoff≥20、AdjustedP-value<0.05”的筛选条件，搜索活性成分及其药物靶点。利用Universal Protein Resource(https://www.uniprot.org/)将靶点名称校正为“Gene Symbol”，剔除无对应基因名和非人源靶点。利用GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、DrugBank(https://www.drugbank.com/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)和PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)数据库，以“COVID-19”为关键词，检索COVID-19疾病靶点。

1.2 构建“药物-活性成分-靶点”拓扑网络将药物靶点和疾病基因导入Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)中映射，二者交集靶点即为防治COVID-19的潜在作用靶点。利用R语言编辑脚本文件，安装并运行Bioconductor数据工具(http://www.bioconductor.org/)，将共有基因“Symbol”转化为“Entrez ID”。通过Cytoscape 3.8.2构建“药物-活性成分-靶点”可视化网络。

1.3 构建交集靶点蛋白互作网络将交集靶点批量导入STRING(https://cn.string-db.org/)数据库中。选择物种为“Homo sapiens”，设置“minimum required interaction score>0.90”，得到交集靶点蛋白互作网络。调整网络中的节点位置，使其排列紧凑且有序，以便观察各节点的互作关系。

1.4 构建核心靶点网络将交集靶点蛋白设置节点属性，批量导入Cytoscape软件中，利用“CytoNCA”插件分析PPI网络中的核心靶点。利用Excle中位数公式，计算出各节点BC、CC、DC、EC、LAC、NC的中位值。根据中位值大小筛选出每项均大于中位值的靶点。构建“儿童预防方”防治COVID-19核心靶点网络图，导出核心靶点的拓扑参数。

1.5 GO功能和KEGG通路分析利用R语言软件编辑脚本文件，设置过滤条件“P值<0.05”。从Bioconductor数据工具中查找“BioManager”、“DOSE”、“clusterProfiler”、“enrichplot”和“pathview”引用包对应安装命令，运行脚本进行安装。进行GO功能、KEGG通路分析，搜索“Description”与COVID-19相关的信号通路，绘制通路示意图。

1.6 分子对接选取核心靶点网络和“药物-活性成分-靶点”拓扑网络中的共有基因。结合“药物-活性成分-作用靶点”拓扑网络中Degree值排名，得到排名前6的小分子配体。利用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找小分子配体的2D结构，将小分子配体2D结构在ChemBio3D Ultra 16.0软件中转化为3D结构，进行“最小自由能”优化。通过UniProt搜索靶点基因“Entry”，将“Entry”复制到PDB(https://www.pdbus.org/)数据库，查找靶点基因的三维结构。使用PyMOL对蛋白受体进行去水、去小分子配体等。利用AutoDock Tool对蛋白受体进行加氢。在二维结构下绘制活性口袋。通过AutoDock Vina、PyMOL软件对分子对接结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 药物及COVID-19疾病靶点筛选通过TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM数据库筛选出418种有效活性成分。利用UniProt将靶点标准化，选取与人相关的靶点，得到1 715个药物靶点。活性成分与其靶点数量关系，见Fig 1。通过GeneCards、OMIM、DrugBank、TTD和PharmGkb数据库联合筛选疾病靶点，剔除重复值，得到1 289个疾病靶点。通过Venny 2.1.0将药物靶点与疾病基因取交集，得到266个靶点，占并集靶点的0.97，见Fig 2。

Fig 1 Distribution of active ingredients and corresponding targets

Fig 2 Venn diagram of intersection targets

2.2 “药物-成分-靶点”网络构建将药物及其活性成分、交集靶点赋予各自属性，通过Cytoscape 3.8.2构建“药物-成分-靶点”网络，见Fig 3。粉红色圆形图标代表活性成分，淡黄色菱形图标代表交集靶点，淡绿色圆形图标代表药物。经“Analyse Network”功能计算得出，网络图共有609个节点和2 741条边，平均邻数为8.985，网络直径为8，网络半径为5，特征路径长度为3.254。

2.3 蛋白互作网络分析将交集靶点导入STRING数据库，选用Multiple proteins工具，将Organism定义为“Homo sapiens”，绘制蛋白相互作用网络，见Fig 4，5。PPI网络有248个节点和1 134条边，校正后P值<1.0e-16，平均节点度为9.15，平均局部集聚系数为0.363。通过MCODE插件提取关键蛋白模块进行描述分析，得到4组核心模块，见Fig 6。

Fig 3 “Drug-component-target”network

Fig 4 Protein interaction network

Fig 5 PPI network of intersection targets

Fig 6 Core modules for COVID-19 prevention and treatment

2.4 核心靶点预测通过CytoNCA插件分析PPI网络的核心靶点。第一轮得到64个核心靶点，第二轮得到25个核心靶点，第三轮得到9个核心靶点(Fig 7～9)，即AKT1、JUN、STAT3、IL2、NR3C1、RELA、MAPK1、MAPK3和MAPK14。核心靶点的拓扑信息见Tab 1。

2.5 生物功能通路分析生物功能通路分析得到3 373条GO富集条目和202条KEGG信号通路(P<0.05)。GO功能富集结果包括生物过程(biological processes，BP)3 030个、细胞组成(cell composition，CC)118个、分子功能(molecular function，MF)225个。选取GO功能富集每组P值排名前10的条目绘制条形图和气泡图，见Fig 10，11。由图可知，BP主要与抗氧化反应、凋亡信号通路的调控、活性氧代谢过程、对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应、正向调节细胞因子的产生等有关。CC主要与囊腔、膜筏、膜微区、胞质囊腔、分泌颗粒内腔、孔复合体等相关。MF主要与细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活动、信号受体激活物的活性、泛素样蛋白连接酶的结合、蛋白酶绑定等相关。

选择KEGG通路分析P-value值排名前30的信号通路绘制条形图和气泡图，见Fig 12，13。由图可知，靶点主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、美洲锥虫病、人巨细胞病毒感染、卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染、肿瘤坏死因子信号通路等。

Fig 7 First round of screening

Fig 8 Second round of screening

Fig 9 Relationship diagram of core targets

Fig 10 Bar chart of GO function analysis

Tab 1 Topological information of core target proteins

Fig 11 Bubble diagram of GO function analysis

Fig 12 Bar chart of KEGG pathway analysis

2.6 分子对接“药物-活性成分-靶点”拓扑网络中Degree值排名前6的小分子配体依次为：槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、汉黄芩素(wogonin)、熊果酸(ursolic Acid)和柚皮素(naringenin)。将关键成分和核心靶点(RELA、AKT1、STAT3、JUN、MAPK1和MAPK3)进行分子对接，靶点与关键活性成分、内源性配体的结合能见Tab 2。结合能代表分子构象稳定性，结合能<0 kcal·mol-1提示分子之间具有结合活性，<-5.0 kcal·mol-1提示分子之间具有较强的结合活性。与内源性配体相比，核心靶点与关键活性成分的结合能绝对值更大，表明这些活性成分更容易与核心靶点结合。采用微生信数据分析工具(http://www.bioinformatics.com.cn)，设置聚类方向为“row+col”，聚类方法为“complete”，距离方法为“Euclidean”，绘制分子对接结合能热图(Fig 14)。利用PyMOL将构象稳定的蛋白受体与分子配体进行分子对接，见Fig 15。

Fig 13 Bubble diagram of KEGG pathway analysis

3 讨论

COVID-19属于中医学“湿毒疫”、“寒湿疫”等范畴，是一种因感受寒湿、温热、浊毒之疠气引起的呼吸道疾病。病位主要在肺、脾，湿毒壅肺、肺气郁闭为重要病机。中医药具有精准施治、全面调治、多靶点干预、多途经防治等优势。在新冠肺炎疫情首次暴发与二次流行期间，中医药能有效阻断病情蔓延，为危急重症患者争取治疗先机。基于儿童脾胃不足、正气素亏的体质和湖南省地域及气候特点，本研究确定了“儿童预防方”主要活性成分：quercetin、luteolin、kaempferol、wogonin、ursolic acid、naringenin。研究表明[2]，quercetin能有效结合SARS-CoV-2主要蛋白酶活性位点，缩短感染持续时间。luteolin与SARS-Cov-2表面尖峰蛋白结合防止病毒侵入机体，具有广泛的抗病毒特性；通过抑制微血管内皮细胞cAMP-磷酸二酯酶活性和黏附分子表达来防治肺炎[3]。kaempferol具有强大抗炎和抗纤维化特性[4]，通过多途径、多靶点、多信号抑制SARS-CoV-2复制。wogonin通过NF-κB信号通路抑制炎性因子的产生，与SARS-CoV-2主要蛋白酶结合而发挥抗病毒作用[5]。Ursolic acid能阻断病毒主要蛋白酶和聚合酶来抑制病毒复制或转录，揭示了熊果酸对SARS-CoV-2的抑制潜力[6]。naringenin能抑制病原体感染后的细胞自噬，减轻炎症反应和肺纤维化，常被用于治疗儿童气道炎症[7]。

Tab 2 Binding energies of core targets and key active ingredients (kcal·mol-1)

Fig 14 Heat diagram of binding energy

Fig 15 Molecular docking diagram

本研究获取了防治COVID-19关键作用靶点：RELA、AKT1、STAT3、JUN、MAPK1和MAPK3。RELA特异性siRNA转染下调脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凝血和纤溶因子表达，STAT3能抑制干扰素应答、诱导免疫应答[8]。研究证实[9]，SARS-CoV-2感染后AKT1能影响细胞内转录、翻译、增殖等功能，减少组织损伤并帮助消除病毒感染。JUN是顶级枢纽宿主蛋白之一，既可以被SARS-CoV-2病毒蛋白直接靶向，还能间接参与病毒感染[10]。MAPK1、MAPK3是SARS-CoV-2感染后启动补体和凝血途径的关键因素，影响着COVID-19重症患者血管内凝血、血栓形成和相关并发症的出现[11]。

KEGG通路富集结果主要与氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、病毒感染等有关。AGE-RAGE信号通路对骨骼和心脏具有重要的保护作用，并参与氧化应激反应和纤维化转导[12]。脂质和动脉粥样硬化产生的炎症环境间接导致COVID-19和病情恶化[13]，其中高密度脂蛋白颗粒水平与病情严重程度呈负相关。胆固醇可间接增加患者对SARS-CoV-2的易感性，增加死亡风险[14]。COVID-19和美洲锥虫病具有相似的作用机制，二者均会出现血管高凝、微血栓沉着和内皮质病变，预防性抗凝治疗可降低患者死亡率[15]。人巨细胞病毒感染是COVID-19患者复发或继发感染的危险因素。此外，感染SARS-CoV-2将诱导巨噬细胞M1极化，促进潜伏巨细胞病毒的再激活[16]。卡波西肉瘤疱疹病毒miRNA能抑制25-羟基胆固醇(25-hydroxycholesterol，25HC)的产生，且25HC已被证明能减少SARS-CoV-2的感染风险[17]。研究表明[18]，SARS-CoV-2辅助蛋白在调节宿主对病毒感染的反应方面具有重要作用，能够激活TNF通路和上调TNF-α表达，加速诱导细胞凋亡。

本研究从网络药理学和分子对接技术出发，初步阐明了“儿童预防方”防治新冠肺炎的作用机制。本研究结果为科研人员提供初步探索和方向，后期的研究仍需通过实验展开进一步验证，旨在为儿童群体防治COVID-19以及药物研究提供支持。