陈蔼如，沈 燕，罗 琼，徐 强

(南京大学生命科学学院，医药生物技术国家重点实验室，江苏 南京 210023)

T淋巴细胞最初来源于骨髓，在胸腺发育并经历阳性选择和阴性选择之后，成熟的T细胞来到外周淋巴器官。正常情况下，这些T淋巴细胞处于静息状态，一旦遇到“非己”抗原，便会迅速增殖进入炎症部位发挥免疫功能。当外来物被清除的时候，为了维持免疫稳态，活化的T淋巴细胞必须立刻被清除，否则会引起自身免疫性疾病[1]。T淋巴细胞在没有接收到相应共刺激信号，而T淋巴细胞受体(T cell receptor)又被再次刺激的时候，会通过Fas/FasL信号通路发生活化诱导的细胞死亡。这种调节机制可以避免效应T淋巴细胞过度表达产生的炎症反应，维持外周的免疫耐受，同时还能保存记忆细胞[2]。人类多发性硬化(multiple sclerosis，MS)的患者体内就出现了这一机制的差异性表达：相较于健康人群，MS患者的Th1细胞对活化诱导的细胞死亡更加敏感，而Th17、Th1/17细胞则出现了抵抗[3]。因此，开发调控活化诱导的细胞死亡的药物对自身免疫性疾病的治疗有着积极作用。

白藜芦醇(resveratrol，Res)，化学名为3，4’，5-三羟基-1，2-二苯基乙烯，是天然的多酚类植物抗毒素，也是非黄酮类植物雌激素[4]。Res在人们日常食用的果蔬(例如葡萄、花生、桑葚、大豆等)中大量存在，并且具有广泛的药理学活性，在抗氧化、抗炎、抑癌、免疫调节、神经保护等方面都有很好的效果[5]。本文重点考察Res促进活化T淋巴细胞凋亡发生的作用特点，并探讨其分子机理，在此基础上考察Res对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的治疗效果。

1 材料

1.1 实验动物健康C57BL/6J雌性小鼠，体质量18～20 g，6～8周龄，购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司[生产许可证号：SCXK(苏)2018-0008]，饲养于南京大学生命科学学院动物实验室，在(21±2) ℃、自由取食、自由饮水和12 h昼夜交替的SPF级条件下饲养。所有动物实验均在南京大学实验动物委员会的批准下进行，且实验方法符合动物实验的相关指南。

1.2 细胞株Jurkat细胞购于中国科学院细胞库。

1.3 试剂Res(R5010)、Caspase Inhibitor VI(219007)、PMA(P8139)、离子霉素(Ionomycin)(I3909)、弗氏不完全佐剂(F5506)、百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX)(P7208)购自MERCK；Purified anti-mouse CD3(145-2C11)、Purified anti-mouse CD28(37.51)购自BD；Mouse IL-2(P04351)购自R&D；Annexin V-EGFP/PI细胞凋亡检测试剂盒(40303ES20)购自翌圣生物；mouse CD4(L3T4)、MicroBeads(130-117-043)购自Miltenyi；结核分枝杆菌H37-Ra(Mycobacterium Tuberculosis H37 Ra)(231141)购自Difco；MOG35-55冻干粉由生工合成；anti-PARP、anti-Caspase-3、anti-Cleaved Caspase-3抗体购自Cell Signaling Technology；anti-Tubulin抗体购自Abmart。

1.4 仪器FACSCaliburTM流式细胞仪(BD)；垂直凝胶电泳仪、电泳槽、转槽(Bio-Rad)；倒置显微镜(Olympus)。

2 方法

2.1 小鼠淋巴结细胞制备无菌摘取正常小鼠的腹股沟、腋下、颈部及肠系膜淋巴结置于盛有RPMI 1640培养基的培养皿中，用5 mL注射器针芯轻柔研磨将淋巴细胞挤出。反复吹打至细胞悬液均匀，通过筛网收集细胞悬液，300g离心5 min。弃上清后用RPMI 1640培养基洗涤1次，计数待用。

2.2 CD4+T淋巴细胞的纯化小鼠CD4+T淋巴细胞纯化按说明书进行。大致流程如下，取淋巴结细胞，离心并重悬于分选液中，每108个细胞加10 μL微珠。在4 ℃孵育30 min，每10 min震荡1次。孵育完离心，用分选液重悬并计数，将细胞密度调整到1010L-1。使用2 mL分选液润洗装架的分选柱，每次500 μL，不能流干。润洗完后，每次500 μL将细胞悬液过柱，然后用2 mL分选液洗柱子。待液体接近流尽时，一次性补加5 mL分选液。最后将分选柱从架子上取下，用注射器推至离心管中，即为纯化的CD4+T淋巴细胞。将纯化后的细胞进行FITC-CD4染色，流式细胞仪检测细胞纯度，纯度大于95%。

2.3 细胞培养收集的淋巴结细胞、CD4+T淋巴细胞以及Jurkat细胞均用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，37 ℃、5% CO2培养。

2.4 活化诱导的细胞死亡模型将纯化的小鼠CD4+T淋巴细胞与anti-CD3/CD28抗体(1 mg·L-1)孵育，培养72 h后，用新鲜无血清培养基洗2-3次，随后置于含50 kU·L-1IL-2的完全培养基中静息培养。静息期间，在不同时间点分别加入Res共培养0、6、12、24、48 h。最后用anti-CD3抗体(1 mg·L-1)和IL-2(100 kU·L-1)再次刺激细胞6 h，诱导活化诱导的细胞死亡。Jurket细胞与Res共孵24 h，随后用新鲜无血清培养基洗2～3次，再用100 μg·L-1PMA和1 mg·L-1离子霉素刺激24 h，诱导活化诱导的细胞死亡。

2.5 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡收集细胞，1 000 r·min-1离心5 min，PBS洗1遍，用1× Binding buffer重悬，先加入Annexin V-EGFP，避光孵育5 min，再加入PI Staining solution和适量PBS，上机检测。

2.6 PI单染检测细胞凋亡收集细胞，1 000 r·min-1离心5 min，PBS洗1遍，加入PI Staining solution和适量PBS，上机检测。

2.7 Western blot检测蛋白表达水平收集细胞，提蛋白定量，沸水煮5 min后，经12.5% SDS-PAGE凝胶分离，湿法转印至PVDF膜。PVDF膜在质量分数为5%的牛奶中封闭2 h后，加入一抗(一抗均1 ∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。次日，用PBST洗3遍，再加入相应的二抗，室温孵育2 h。PBST洗3遍后，用ECL发光液显影。

2.8 小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型取MOG35-55冻干粉溶于PBS中(MOG：200 μg·只-1)；称取结核分枝杆菌溶于IFA中(终浓度6 g·L-1)；将上述两种混悬液按1 ∶1比例充分乳化成油包水状态，制成诱导EAE的乳剂；采用多点注射法，于小鼠颈部及脊柱两旁选3～4点皮下注射0.2 mL乳剂；同时尾静脉注射百日咳毒素0.2 mL(含百日咳毒素 400 ng)；48 h后再次尾静脉注射百日咳毒素0.2 mL。自免疫当天开始，每天给小鼠称体质量，观察，并进行神经功能评分。评分标注为通用的5级评分法：0分，不发病；1分，尾部无力；2分，尾部无力并且不完全后肢(1～2支后肢)瘫痪；3分，双后肢瘫痪；4分，双后肢和任一前肢均瘫痪，被动翻身后不能复位；5分，濒死状态或死亡。以质量分数为0.5%的羧甲基纤维素钠为溶剂对照，给药组小鼠每天灌胃给予100 mg·kg-1Res，给药从免疫当天开始，持续至实验结束。

平儿被停在窗前的一块板上，用白布给他蒙住眼睛。隔院的人们都来看着，因为要晓得“鬼子”怎样治病，“鬼子”治病究竟怎样可怕。

3 结果

3.1 Res促进小鼠活化T淋巴细胞的凋亡将不同浓度的Res与naïve T淋巴细胞或anti-CD3/CD28抗体活化的T淋巴细胞共孵24 h，Annexin V/PI双染细胞后通过流式细胞仪检测凋亡情况。如Fig 1A所示，Res可以剂量依赖性地诱导活化T淋巴细胞进入凋亡，并且大多数凋亡细胞进入晚期凋亡。当Res剂量为20 mg·L-1时，活化T淋巴细胞凋亡率达到0.55。但是，Res对非活化的T淋巴细胞则几乎没有影响(Fig 1B)。

3.2 Res促进T淋巴细胞活化诱导的细胞死亡体外利用纯化的小鼠CD4+T淋巴细胞建立活化诱导的细胞死亡模型。PI单染结果(sub G1峰)显示，与正常组相比，anti-CD3抗体再刺激导致细胞发生凋亡，而Res孵育则让细胞对凋亡更加敏感，T淋巴细胞凋亡的强度和启动速度都明显高于对照组(Fig 2)。

此外，我们在Jurkat细胞上也建立了活化诱导的细胞死亡模型。Annexin V/PI双染实验显示，PMA/离子霉素刺激诱导细胞进入早期凋亡，而Res孵育则剂量依赖性地促进早期凋亡进一步发生(Fig 3)。

3.3 Res通过Caspase通路促进活化诱导的细胞死亡为探讨Res促进活化诱导细胞死亡的方式，我们检测了Caspase 3和PARP的表达量。结果发现与Res共孵后，Jurkat细胞中剪切形式的Caspase 3和PARP增加(Fig 4A)，而这种增加可以被Caspase抑制剂逆转(Fig 4B)。同时，Caspase抑制剂的预处理也明显抑制了Res的促凋亡作用(Fig 4C)。

3.4 Res改善小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型EAE小鼠自d 11开始发病，发病率为37.5%，d 12就已超过50%，并在d 15达到100%，小鼠体质量也从模型发病时开始降低。自免疫当天起每天灌胃给予Res(100 mg·kg-1)干预，并考察其对小鼠EAE的影响，包括体质量变化以及临床评分。如Fig 5A所示，给药组小鼠尽管也从d 11开始发病，但发病率只有12.5%，d 14才达到50%；给药组小鼠发病引起的体质量变化总体趋势与模型组一致，虽差异无统计学意义，但从图中可以看出较模型组相比更为缓和；给药组小鼠的临床评分从d 17开始明显低于模型组(P<0.05)，并一直维持到d 20。HE染色结果表明，Res可以减少小鼠脊髓中炎性细胞的浸润和“血管套”样病变(Fig 5B)。

Fig 1 Dose-effect of Res on apoptosis in activated T lymphocytes (A) and naïve T cells (B)

Fig 2 Effect of Res on activation-induced cell death of CD4+ T cells

Fig 3 Effect of Res on activation-induced cell death of Jurkat cells

Fig 4 Res enhanced Caspase signaling cascades

在模型进展高峰期(d 18)，收集溶剂对照组和给药组小鼠的脾脏和引流淋巴结，分离纯化CD4+T淋巴细胞进行体外培养，并加1 mg·L-1anti-CD3抗体再刺激24 h，检测细胞的凋亡水平。结果表明，给药组小鼠CD4+T细胞凋亡比例相较于溶剂对照组有所增加，但在anti-CD3抗体的诱导下，凋亡水平明显升高，说明给药组小鼠CD4+T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡更敏感(Fig 6)。

Fig 5 Res relieved development of

4 讨论

我们的研究表明Res可以选择性诱导活化T淋巴细胞凋亡，而对非活化T淋巴细胞没有影响，同时还能让T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡更加敏感。Res促进凋亡的机制与Caspase-3和PARP的剪切密切相关。Caspase-3在凋亡信号通路的终末端被剪切激活并发挥作用，其最主要的底物是PARP[10]。PARP是DNA损伤的感受器，参与DNA损伤修复，而在凋亡过程中，PARP被剪切失活，使细胞更加不稳定[11]。我们利用Caspase抑制剂发现Res的促凋亡效应被明显逆转。这样的选择性作用对于免疫性疾病的治疗意义重大，因为免疫性疾病大多需要长期服药，包括环孢素A、糖皮质激素在内的很多免疫抑制剂因其非选择性作用常发生严重的毒副作用[12-13]。

Fig 6 Res promoted activation-induced cell death of CD4+ T lymphocytes in EAE

A:The apoptosis of CD4+T lymphocytes was measured by flow cytometry;B:Quantification of apoptosis level as in A.*P<0.05vsVehicle-treated-anti-CD3-;△P<0.05vsRes-treated-anti-CD3-;##P<0.01vsVehicle-treated-anti-CD3+.

此外，我们还在小鼠EAE模型上考察了Res对免疫性疾病的治疗效果。MS是一种慢性自身免疫病，主要表现为中枢神经系统(central nervous system，CNS)白质炎性脱髓鞘病变[14]。炎症反应在MS的发生和发展过程中起到了重要作用[15]，因为其发病机制主要由T细胞介导。T细胞首先被CNS的自身抗原活化，穿过血脑屏障激活小胶质细胞。这些细胞不仅可以直接损伤神经纤维周围的髓鞘，还能诱导构成髓鞘的少突胶质细胞死亡[16]。EAE是目前研究MS的最佳动物模型。我们的研究表明口服Res可以明显改善模型的各种症状，包括延缓小鼠发病时间、抑制模型严重程度、缓解由于小鼠发病引起的体质量下降，并能减少小鼠脊髓中炎性细胞的浸润，同时给药组小鼠也未见食欲匮乏、行动迟缓等症状，提示并不存在明显副作用。此外，给药组小鼠体内的CD4+T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡更加敏感。接下来，我们将从Caspase-3入手进一步探究Res诱导EAE小鼠中活化T淋巴细胞凋亡的分子机制。

综上所述，Res可以通过激活Caspase-3选择性促进活化T淋巴细胞凋亡，并使其对活化诱导的细胞死亡更敏感，同时在动物模型中也显示出良好的治疗效果。这不仅揭示了Res的作用特点，也提示选择性促进活化的T淋巴细胞凋亡用于治疗自身免疫疾病具有可行性。