饶席兵，钱禛锋，张蓉琼，何丽莲,3，李富生,3*

(1 云南省作物生产与智慧农业重点实验室，昆明 650201；2 云南农业大学 农学与生物技术学院，昆明 650201；3 云南农业大学 甘蔗研究所，昆明 650201)

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)贡献了全球糖产量的80%，是一种重要的糖料作物[1]。甘蔗喜大水大肥，同时，其缺乏耐寒、抗旱等特性，加之中国的地形和气候条件难以满足甘蔗生长发育对水分、温度和光照的需要，从而导致中国蔗区主要分布在广西、云南、广东等南方省市。因此，培育抗逆性强的甘蔗品种，扩大甘蔗种植区域，成为现阶段甘蔗育种的主要方向。由于甘蔗栽培种不易开花，且与近缘物种的花期难遇，通过传统的有性杂交方法难以实现品种性状的定向改良，这些因素导致了甘蔗的育种工作进展十分缓慢[2]。蔗茅(Erianthusfulvus)是甘蔗的近缘野生种，在中国境内分布广泛，具有较好的抗旱、耐寒、耐贫瘠、成熟早、高锤度等很多甘蔗栽培种不具备的优良特性，是改良甘蔗遗传性状十分重要的种质资源材料[3-4]。

基因转录有正调控和负调控之分，转录因子(transcription factor)是起正调控作用的反式作用因子。相关研究表明，转录因子通过特异性结合下游靶基因启动子区域的顺式作用元件从而调控靶基因的表达，使植物代谢和生理性状方面发生特异改变以应对逆境胁迫[5-6]。研究发现主要参与调控植物逆境应答反应的转录因子家族有WRKY、NAC、ZFPs、MYB、和AP2/ERF等[7]。其中，MYB家族转录因子是数量较多，最为重要的转录因子之一，在调节植物次生代谢，参与信号传导、生物与非生物胁迫应答以及激素反应等过程中扮演着十分重要的角色[8-11]。

研究表明，拟南芥(Arabidopsisthaliana)MYB转录因子超过198个[12]、水稻(OryzasativaL.)超过183个[13]。首个MYB转录因子于1982年在禽成髓细胞瘤病毒(AMV)中发现，并命名为v-MYB[14]。植物中第一个被发现的MYB转录因子基因是从玉米(ZeamaysL.)中克隆出来的ZmMYBCI，并发现该基因在花青素合成过程中起调控作用[15]。随着组学、测序、转基因和基因编辑技术的不断发展，许多物种中的MYB家族转录因子已被鉴定，MYB转录因子的功能及其相关调控机理也逐渐被解析[16]。

低温是限制植物生长、产量和分布的主要环境因子之一，MYB转录因子因其调控低温应答关键转录因子CBFs表达，进而激活众多下游冷应答基因CORs表达，被认为在植物冷胁迫应答反应中扮演着重要的角色[17]。在拟南芥[18]、大豆(Glycinemax)[19]、番茄(Solanumlycopersicum)[20]、水稻[21]、玉米[22]等植物中，众多MYB基因能被低温胁迫诱导而表达，进一步参与植物低温应答网络调控。然而，在甘蔗及其野生近缘种内，相关的研究一直鲜有报道。本研究通过结合蔗茅低温胁迫下的转录组数据，利用RT-PCR等技术从蔗茅中克隆到EfMYB1基因，并对该基因与编码蛋白进行生物信息学分析以及不同胁迫处理的基因表达差异分析，为丰富甘蔗育种候选基因库和转基因甘蔗育种提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料与处理

本研究涉及的试验材料均来源于云南农业大学甘蔗研究所野生资源圃。用于低温胁迫处理的材料为蔗茅99-1无性系，于温室大棚内种植于花盆，对照组CK(0 h)于温室大棚中正常生长，处理组(24 和72 h)待生长至5叶期时转移至光量子通量密度为300 μmol·m-2· s-1，光周期为12 h/d，相对湿度为60%～70%，于低温(4 ℃)光照培养箱中进行低温胁迫处理。用于脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫处理的材料为蔗茅99-1无菌组培苗，处理组(6和12 h)用浓度为100 μmol/L ABA和MeJA溶液喷施整株，对照组CK(0 h)则喷施无菌水，于28 ℃、光强1 500～2 000 Lx、光周期12 h/d的条件下培养。以上处理均3次重复。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取和cDNA合成在胁迫处理各时间点，分别取低温胁迫处理的根(新生白根)、茎(中上段)、叶(+1叶)，ABA和MeJA胁迫处理的叶组织，置于液氮取回-80℃冰箱中保存。利用Tigen TrizolRNA提取试剂盒(天根，昆明)进行总RNA提取，提取的RNA于超净工作台下吹晾3 min，加入40 μL RNase-Free ddH2O进行溶解混匀。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA，并用紫外分光光度仪进一步确定浓度。利用Fast Quant RT Super Mix快速反转录试剂盒(天根，昆明)将质量较好的RNA反转录成cDNA第一链备用。

1.2.2EfMYB1基因的引物设计与克隆利用 Primer 6.0 软件，根据EfMYB1基因序列设计扩增引物(表1)。使用PrimeSTAR®GXL Premix酶(宝生物，昆明)，以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系为：酶25 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，DEPC处理水补足至50 μL。扩增程序为：98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 45 s，30个循环。PCR扩增程序结束后取5 μL PCR反应物进行1%凝胶琼脂糖电泳检测，利用胶回收试剂盒(天根，昆明)进行目的片段回收纯化，用pLB vector试剂盒(天根，昆明)连接至克隆载体。转化至大肠杆菌DH5α感受态后于LB固体培养基上培养，然后进行菌落鉴定与测序分析。

表1 实验所用引物

1.2.3EfMYB1基因的生物信息学分析使用ORF find、Conserved Domain Search在线网站预测EfMYB1基因的开放阅读框(ORF)和保守结构域(CDD)。用 DNAMAN 6.0 软件推导EfMYB1基因的氨基酸序列。利用SignaIP-3.0、TMHMM Server V2.0、Nephrons 2.0 Server分别预测编码蛋白的信号肽、跨膜结构及磷酸化位点。蛋白二级结构用CFSSP在线软件分析，三维结构建模用 SWISS-MODEL在线软件预测。用MEGA7.0 进行EfMYB1蛋白多序列比对和系统发育树构建。

1.2.4EfMYB1基因实时荧光定量表达分析使用 Primer 6 软件根据EfMYB1基因开放阅读框设计荧光定量引物MYB-F2、MYB-R2，选用肌动蛋白基因β-actin25S-F、β-actin25S-R作为内参基因引物(表1)。以低温、ABA和MeJA胁迫处理反转录成的cDNA为模板，使用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) SuperReal 荧光定量预混试剂增强版试剂盒(天根，昆明)，在ABI7500荧光定量PCR仪上进行PCR反应，每个样品设置3个重复。反应体系为：2×Real Star Green Fast Mixture with ROX 25 μL,正反向引物各1 μL，模板1 μL，DEPC处理水补足至50 μL。反应程序为：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环，用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

2 结果与分析

2.1 RNA提取与EfMYB1基因克隆分析

利用凝胶成像系统观察到提取出的RNA条带清晰可见，没有发生降解(图1，A～D)。紫外分光光度计测得大多数RNA的OD260/280在1.8～2.0之间，表明RNA提取纯度较高，几乎没有污染，可用于反转录后续试验所需的cDNA。PCR扩增反应物经电泳检测，发现大约在900 bp处有一条清晰的条带(图1，E)，经北京擎科生物公司测序得到1条长度为1 000 bp大小的序列，表明该基因已成功克隆。

M. DL2000; A(叶片)、B(根): 1～3. CK; 4～6. 24 h冷胁迫; 7～9. 72 h冷胁迫; C. 茎:1～4. CK; 5～8. 24 h冷胁迫; 9～12. 72 h冷胁迫; D.叶片:1～3. CK; 4～6. 6 h ABA胁迫; 7～9. 12 h ABA胁迫; 10～12. 6 h MeJA胁迫; 13～15.12 h MeJA胁迫; E. EfMYB1(1～2)

2.2 EfMYB1基因编码蛋白生物信息学分析

将测序得到正确的EfMYB1基因序列在NCBI上进行开发阅读框ORF预测，获得一个全长759 bp的ORF，编码251个氨基酸(图2，A)。EfMYB1蛋白保守结构域预测发现，该蛋白具有一个较典型的SANT结构域，位于氨基酸序列的第18～70位。(图2，B)EfMYB1蛋白亲/疏水性分析发现，得分在0以下的区域占绝大部分，且亲水性平均值为-0.73，说明该蛋白质属于亲水性蛋白。EfMYB1蛋白二级结构由51.59%无规卷曲、34.52%α螺旋和13.89%β折叠构成(图3，B)，三级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主(图3，A)，与二级结构预测结果一致。蛋白质信号肽检测结果显示，该蛋白质无信号肽，属于非分泌蛋白(图3，C)。蛋白跨膜结构预测结果表明，该蛋白质不具备跨膜结构，属于膜外蛋白(图4，A)。磷酸化位点预测发现，ErMYB1多肽链中含有多个丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)磷酸化位点(>0.5)(图4，B)，推测蛋白激酶易与该蛋白质作用。

A. 核酸及氨基酸序列; B. 保守结构域

A. 二级结构；B. 三维建模；C. 信号肽预测[Signal 0.5预测(真核)序列]

A. 跨膜结构预测; B. 磷酸化位点预测

2.3 EfMYB1同源蛋白比对及系统进化树构建

为进一步了解该蛋白的功能和进化特征，通过NCBI蛋白数据库搜索到与蔗茅EfMYB1蛋白序列相似的同源蛋白分别来自南荻(Miscanthuslutarioriparius)94.86%、高粱(Sorghumbicolor)92.22%、玉米(Zeamays)81.47%、寡花菊(Dichantheliumoligosanthes)79.91%、谷子(Setariaitalica)78.60%、黍(Panicummiliaceum)78.29%、疣粒稻(Oryzameyerianavar.granulata)62.45%、大麦(Hordeumvulgaresubsp.vulgare)56.28%、节节麦(Aegilopstauschii)55.4%。多序列比对结果表明，蔗茅EfMYB蛋白与节节麦MYB蛋白的相似性最低，而与南荻MYB蛋白、高粱MYB蛋白的相似性最高(图5)。进一步构建系统发育树，结果显示，蔗茅EfMYB与南荻MYB亲缘关系最近(图6)。

图5 EfMYB1与其他物种蛋白序列比对结果

图6 不同植物MYB蛋白系统进化树

2.4 EfMYB1基因不同胁迫下的表达分析

分别以低温、ABA、MeJA胁迫处理的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR分析，进一步分析EfMYB1基因在不同胁迫条件下的表达。结果(图7，A)显示，低温胁迫不同时间，EfMYB1基因在根、茎、叶组织中的表达量不同。在根和叶组织中，EfMYB1基因的表达量随低温胁迫时间的持续逐渐上调；在茎组织中，低温胁迫对EfMYB1基因的表达几乎没有影响。这说明该基因可能在蔗茅根和叶中发挥作用，进而参与蔗茅冷胁迫应答反应。

ABA与MeJA胁迫不同时间，EfMYB1基因的相对表达量也存在差异(图7，B)。MeJA胁迫下，EfMYB1基因的相对表达量呈先升高后降低的趋势，在处理6 h时达到最大值，且极显著高于0 h。而脱落酸胁迫下该基因的表达水平极显著低于0 h，表明蔗茅中该基因功能可能不依赖于脱落酸诱导。

A.低温胁迫; B. ABA和MeJA胁迫；*和**分别表示同一组织(胁迫)不同处理时间基因表达差异达显著 (P<0.05)或极显著水平(P<0.01)

3 讨 论

经过漫长的自然选择与进化，植物形成了其特有的调控机制，来适应环境中的种种危害。如通过一些抗逆基因发挥功能来调控植物生长发育的各个生理过程，而调控过程需要一些相关酶和调节蛋白的参与，MYB转录因子就属于这种调节蛋白。MYB蛋白的活性与其磷酸化方式有关。相关研究表明，通过激酶对C端磷酸化可激活烟草NtMYB2基因的转录活性[23]。拟南芥ACC1蛋白经酪蛋白激酶2磷酸化后，可以提高与靶基因启动子基因结合的能力[24]。本研究中克隆到的EfMYB1基因经生物信息学分析预测，发现该蛋白有多个磷酸化位点，因此，推测该MYB蛋白活性也可能和蛋白质磷酸化有关。

根据R结构个数不同，可将MYB转录因子分为1R-MYB/MYB-related、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB四个亚类。本研究得到的EfMYB1蛋白包含1个该家族典型的SANT结构域，推测属于1R-MYB。相关研究表明，1R-MYB具有维持染色体结构的完整性和调节基因转录过程等作用[25]，故推测蔗茅EfMYB1基因也有类似功能。对编码蛋白亲疏水性预测时，发现得分数小于0的区域密集度明显较高，结合亲水性平均值分析，表明该蛋白质是一种亲水性蛋白。进行跨膜结构预测时，没有发现该编码蛋白的跨膜结构，信号肽检测结果显示，该基因编码蛋白没有信号肽，说明蛋白的稳定性比较高，不易被降解。为进一步了解该EfMYB1蛋白的功能和进化特征，进行了蛋白多序列比对。结果表明蔗茅MYB蛋白与南荻MYB蛋白相似性最高，遗传距离最近，表明该基因的功能可能与南荻中的同源基因功能相似。

Dong等[26]发现蔷薇RmMYB108基因能被低温胁迫诱导表达，在拟南芥中过表达该基因显著提高了转基因植物的耐寒性；持续低温环境下，与野生型株系相比，转基因株系表现更高的存活率和生长速率及更优的种子数量。Li等[27]发现玉米ZmMYB31基因的表达也受低温胁迫诱导，过表达该基因能影响低温响应基因的表达水平、转基因株系的活性氧含量及光合强度等，从而赋予植物更强的低温耐性。本研究在荧光定量表达分析时发现，低温胁迫可以诱导EfMYB1基因在蔗茅根和叶组织中表达，且表达水平随低温胁迫时间的持续逐渐上调，故推测该基因属于低温胁迫诱导型表达基因，主要在蔗茅根组织和叶组织中行使功能，从而赋予蔗茅较强的耐寒性。

刘佳欣等[28]研究了不同激素处理对MYB基因表达的影响，发现ABA胁迫能诱导白桦MYB基因表达。而在本研究中，施加ABA胁迫后EfMYB1基因的相对表达量反而较CK降低，这可能是因为MYB基因的表达不依赖于ABA。 陆苗等[29]的研究表明，菘蓝LiMYB34基因受MeJA显著诱导，且在MeJA胁迫6 h时其相对表达量达到最大值，本研究得出的结果与该结果一致。

本研究通过结合蔗茅低温胁迫下的转录组数据，首次从蔗茅中克隆到一个MYB基因，荧光定量PCR分析结果表明，该基因属于低温胁迫响应基因，可能参与蔗茅在低温胁迫下的应答反应。本研究为深入解析蔗茅的耐寒机理及转基因甘蔗育种提供理论基础。