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药用复合膜原料膜及添加物体外细胞毒性研究

2022-11-09洪燕游媛刘宁龚玮郑洋滨

药品评价 2022年15期
关键词:复合膜甲苯黏合剂

洪燕,游媛,刘宁,龚玮,郑洋滨

江西省药品检验检测研究院,国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室,江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心,江西 南昌 330029

细胞毒性检查法是将供试品或者供试品接触细胞,通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察,评价供试品对体外细胞的毒性作用,常用的方法有MTT 法、细胞计数法、碘化丙碇(PI)染色法等[1]。《国家药包材标准》中细胞毒性可分为相对增殖度法、琼脂扩散法、直接接触法和浸提法4 种[2]。

药用复合膜由各种塑料与纸、金属或者其他材料通过层合挤出贴面、共挤塑等工艺技术将基材结合在一起而形成的多层结构的膜,可用于直接接触各类药物制剂的包装,是药品的重要组成部分,厚度一般不大于0.25 mm[3-4]。在药用复合膜的生产过程中,为了改善膜材的质量及品质,或有利于加工生产,须加入一些化学助剂,如增塑剂、稳定剂、成核剂等[5]。复合膜在生产时会涂布黏合剂使不同的膜材进行复合,使用最多的为聚氨酯类胶黏剂,其中存在的芳香胺和有机溶剂也为有毒物质。其次大部分印刷的油墨中含有有毒有害物质,包括重金属、有机挥发物、残留的溶剂等等,这些均存在安全隐患[6]。

基于目前对复合膜原料的细胞毒性研究尚不完善,本次实验采用MTT 法,对18 种复合膜原料、2 种黏合剂添加物及9 种油墨添加物进行细胞毒性研究,为药包材质量的监督管理提供依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

L929 细胞(ATCC)、MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑盐溴化物]、1640完全培养基、胎牛血清、生理盐水、二甲基亚砜(DMSO)。

1.2 仪器

电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司],酶标仪(赛默飞世尔科技公司),CO2恒温培养箱(赛默飞世尔科技公司),倒置显微镜(奥林巴斯株式会社)。

1.3 实验样品

试验选取6个厂家的不同批号复合膜18批(PET膜、PE 膜、VMPET 膜),黏合剂添加物2 种(2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯)和油墨添加物9 种[荧光增白剂KSN、荧光增白剂378、1,4-二(2-氰苯乙烯)苯、1,4-二(2-苯并唑基)萘、4,4,-双(2-苯并唑基)二苯乙烯、2,5-双(苯并唑-2-基)噻吩、7-二乙氨基-4-甲基香豆素、2,5-二(5-叔-丁基-2-苯并唑基)噻吩、荧光增白剂135]共29 个样本。

2 实验方法

2.1 MTT 溶液的配制

取MTT 500 mg 溶于100 mL PBS 缓冲液中,浓度为5 mg/mL,过滤除菌,4 ℃避光保存。

2.2 样品浸提液的制备

见表1。

表1 供试品前处理

2.3 细胞毒性增殖度实验方法

取正常生长并处于对数生长期的L929 细胞,消化吹打计数,稀释至浓度为1×104/mL,精密吸取100 μL 细胞悬液注入细胞培养板内,放入含5%的CO2的恒温培养箱中37 ℃培养24 h。弃去原培养液,换成各种供试液,每组6 孔,同时设立阳性对照组(10% DMSO),阴性对照组(聚丙烯输液袋浸提液),空白对照组(1640 完全培养基各100 μL 每孔),再置细胞培养箱中37 ℃继续培养,同步实验。72 h 后,小心吸弃孔内上清液,每孔加入20 μL 浓度为5 mg/mL 的MTT 溶液,继续孵育培养4 h 后终止培养。小心吸弃孔内上清液,每孔分别加入150 μL DMSO,振荡10 min,使结晶物充分溶解,在酶标仪上用双波长(570 nm、630 nm)测定各孔吸光度,计算相对增殖度(RGR),RGR=供试品吸光度/空白对照组吸光度×100%[7]。

2.4 结果判定标准

样品的细胞毒性可采用细胞毒性分级表评价,见表2。

表2 细胞毒性分级表

3 实验结果

3.1 不同浸提条件对复合膜原料膜细胞毒性的影响

结果显示用3 种不同的浸提方法进行试验,RGR 值测定结果在80~110,细胞毒性分级在0~1,呈现无毒或轻微毒性,见表3。

表3 不同条件下复合膜原料膜细胞毒性试验结果 %

3.2 黏合剂添加物细胞毒性测定及比较

根据黏合剂添加物不同浓度的细胞增殖度,用SPSS 软件计算半抑制浓度(IC50)[8-9]。结果显示,2,4-二氨基甲苯在高浓度下(10~0.156)mg/mL 显示出极强的细胞毒性,毒性分级在3~4 级;随着稀释倍数的增加(0.078~0.039)mg/mL,细胞毒性逐渐降低,毒性分级基本在1~2 级,呈现出轻微毒性。2,6-二氨基甲苯同样在高浓度下(10~0.625)mg/mL 下显示出极强的细胞毒性,毒性分级在3~4级;随着稀释倍数的增加(0.313~0.039)mg/mL,细胞毒性逐渐降低,毒性分级基本在1~2 级,呈现出轻微毒性。不同浸提条件下,2,4-二氨基甲苯IC50值(0.06 9~0.124 mg/mL),均小于2,6-二氨基甲苯IC50值(0.370~0.566 mg/mL),显示2,4-二氨基甲苯的L929 细胞毒性大于2,6-二氨基甲苯。见表4。

表4 黏合剂添加物不同浸提条件RGR和IC50测定结果

3.3 油墨添加物细胞毒性测定及比较

根据油墨添加物不同浓度的细胞增殖度,用SPSS 软件计算IC50。结果显示在37 ℃浸提条件,生理盐水为浸提介质下,8 种添加物在各个浓度下均无细胞毒性,毒性分级基本在1~2 级,呈现出轻微毒性;1 种添加物7-二乙氨基-4-甲基香豆素在高浓度时下(10,5)mg/mL 显示出细胞毒性,毒性分级在3~4 级;细胞毒性随稀释倍数的增加逐渐降低,毒性分级基本在0~2 级,呈现出轻微毒性或无毒。在37 ℃浸提条件,完全培养基为浸提介质下,6 种添加物在各浓度下无细胞毒性,毒性分级基本在1~2 级,呈现出轻微毒性。3 种添加物[荧光增白剂378,1,4-二(2-氰苯乙烯)苯,7-二乙氨基-4-甲基香豆素]在高浓度时呈现出细胞毒性,毒性分级在3~4 级,细胞毒性随稀释倍数的增加逐渐降低,毒性分级基本在0~2 级,呈现出轻微毒性或无毒。在121 ℃浸提条件,生理盐水为浸提介质下7 种添加物在各浓度下无细胞毒性,毒性分级基本在1~2 级,呈现出轻微毒性。2 种添加物[1,4-二(2-苯并唑基)萘,7-二乙氨基-4-甲基香豆素]在高浓度时呈现出细胞毒性,毒性分级在3~4 级,细胞毒性随稀释倍数的增加逐渐降低,毒性分级基本在0~2 级,呈现出轻微毒性或无毒。见表5。

表5 油墨添加物不同浸提条件RGR测定结果

4 结论

复合膜原料膜用3种不同的浸提方法进行试验,细胞毒性分级在0~1,呈现无毒或轻微毒性。说明该类产品安全可靠。

黏合剂添加物试验结果显示,黏合剂添加物在37 ℃的浸提条件下显示出比121 ℃更强的细胞毒性,121 ℃浸提条件下的IC50值明显高于37 ℃浸提条件的IC50值。

油墨添加物结果表明,较高浓度的油墨添加物7-二乙氨基-4-甲基香豆素在不同的浸提条件及浸提介质下均表现出细胞毒性作用。在37 ℃浸提条件,培养基为浸提介质下更有利于有毒物质的浸出,而表现出更强的细胞毒性。

药用复合膜是固体制剂的主要包装材料,可用于直接接触各类药物制剂,是药品的重要组成部,为保证其使用的安全,减少不良反应的发生,应在其原有标准中增加细胞毒性检查项。

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