范丹阳, 张学成, 高 俊, 王家斌, 吕海霞*

1. 福州大学材料科学与工程学院，福建 福州 350108 2. 福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350108

引 言

磺胺二甲氧嘧啶(SDM)是一种常见的抗菌感染药物，在世界各地广泛用于预防或治疗家禽疾病。由于过度使用，其在环境中的残留可能会对人体造成危害。较为常用的检测磺胺二甲氧嘧啶的方法有高效液相色谱(HPLC)[1]、 高效毛细管电泳(CE)[2]和液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS)[3]等，虽然现有方法具有一定的可靠性与准确性，但大多具有仪器较昂贵、 难操作、 耗时久或样品预处理繁琐等缺点，限制了在SDM检测上的应用，因此有必要开发新的检测方法克服现有检测技术上的不足。

近年来，荧光探针由于其低检测限、 检测速度快、 不依赖复杂仪器而在检测领域受到广泛应用。Chen[4]等采用一种基于适配体与量子点用于检测SDM的荧光传感器，通过静电作用，使适配体(Aptamer)和聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)形成双链，阻碍了PDDA对量子点荧光的猝灭，但适配体与SDM的特异性结合可能导致游离的PDDA释放，导致荧光被淬灭，从而实现对水样和鱼类样品中残留SDM的快速检测。然而现有用于检测SDM的方法大部分使用有机染料或量子点，通常具有光化学稳定性差和光漂白等缺点，且在紫外可见光激发下还会受到生物样品基质的背景干扰，限制了其在复杂样品基质中的使用。与传统的荧光团相比，上转换纳米粒子(UCNPs)具有独特的优势，例如高的生物穿透性、 窄的发射峰、 大的斯托克位移[5]等优点，因此具有用作荧光探针的巨大潜力，进而被广泛用于各种物质的检测，例如毒素[6]、 细菌[7]、 农药[8]及抗生素[9]等，但目前有关于UCNPs用于SDM检测的研究仅见Liu等[10]利用沉积在适配体功能化后的磁性纳米粒子的表面上的UCNPs与SDM间的亲和性及磁性纳米粒子易于分离的优点，构建了一种对SDM的特异性且高灵敏度复合荧光探针，但该复合探针的制备及检测过程较为繁琐，因此开发出简便易于操作用于检测SDM的上转换纳米材料探针仍是一项挑战。

针对现有检测 SDM 的技术问题，合成了氯化镱、 氯化钇、 氯化铒作为稀土原料，油酸(OA)作为配体的上转换纳米粒子(OA-UCNPs)，对其进行表面羧基功能化后得到亲水性上转换纳米粒子 PAA-UCNPs，再将其进行适配体功能化得到偶联适配体的上转换纳米粒子(Apt-UCNPs)，构建了基于Apt-UCNPs的检测体系，并针对共振能量转移效应(FRET)与碱基互补配对原则对检测机理进行了探讨，验证了检测方法的可行性；该检测体系克服了传统方法的不足，具有操作简便、 耗时少且不依赖昂贵仪器的优点，并对于磺胺二甲氧嘧啶的检测具有特异性，实现了对SDM的特异性检测，为磺胺二甲氧嘧啶的检测提供了简便且有效的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

FluoroMax-4型荧光光谱仪(法国HORIBA Jobin Yvon公司)；2450型紫外-分光光度计(日本岛津公司)；Nicolet 5700型傅里叶红外光谱仪(美国热电公司)；SUPRA 55型场发射扫描电子显微镜(德国卡尔蔡司有限公司)。

氢氧化钠(NaOH)、 无水乙醇(C2H5OH)、 环己烷(C6H12)、 六水氯化钇(YCl3·6H2O)、 六水氯化镱(YbCl3·6H2O)、 六水氯化铒(ErCl3·6H2O)、 油酸(OA)、 1-十八烯(ODE)、 甲醇(CH3OH)、 氟化铵(NH4F)、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(sulfo-NHS)、 二甲基亚砜(DMSO)均购于阿拉丁化学试剂有限公司；氩气(Ar2)购于福州华鑫达气体有限公司；聚丙烯酸(PAA)、 一缩二乙二醇(DEG)、 甲苯(C7H8)、 氯化钠(NaCl)、 氯化钾(KCl)、 氯化镁(MgCl2)均购于国药集团化学试剂有限公司；SDM适配体(序列：NH2-GAG GGC AAC GAG TGT TTA TAG A-3)、 黑洞猝灭剂cDNA-BHQ1(序列：5′-CGT TGC CCT C-BHQ1)均购于上海生工生物工程股份有限公司，无特殊说明，试剂纯度为分析纯。

实验所用水为超纯水，所用缓冲液配制：20 mmol·L-1Tris-HCl，50 mmol·L-1NaCl，5 mmol·L-1KCl，5 mmol·L-1MgCl2，pH 8.0。

1.2 聚丙烯酸改性的上转换纳米粒子(PAA-UCNPs)的合成

根据文献[11]合成了PAA-UCNPs，并做了少量修改：将0.78 mmol的YCl3·6H2O、 0.2 mmol的YbCl3·6H2O和0.02 mmol的ErCl3·6H2O加入至100 mL三口烧瓶中，再加入21 mL的OA/ODE为6∶15的溶液，通入氩气后在磁力搅拌下缓慢升温至110 ℃除水10 min，然后加热至160 ℃保温30 min，直到稀土氯化盐完全溶解。冷却后加入10 mL溶有4 mmol NH4F和2.5 mmol NaOH的甲醇，于50 ℃保温30 min，再升温至80 ℃除去甲醇溶液，然后将混合溶液快速加热到300 ℃下保温1.5 h。加入乙醇沉降后，离心收集得到OA-UCNPs纳米粒子。

在100 mL三口瓶中加入200 mg的PAA，再倒入30 mL的DEG，将混合物加热至110 ℃，形成澄清溶液。缓慢加入分散有50 mg 的OA-UCNPs纳米晶体的2 mL甲苯溶液，并在氩气保护下将温度升高至130 ℃保持10 min除去甲苯，然后将溶液升高至一定温度回流保温一段时间。反应完后将所得溶液冷却至室温，并加入0.2 mol·L-1的NaCl溶液以使粒子沉淀。最后将粒子离心出来，得到PAA-UCNPs。

1.3 Apt-UCNPs的合成

将200 μL EDC(0.2 mol·L-1)和400 μL sulfo-NHS(0.2 mol·L-1)添加到2.5 mL含有4 mg PAA-UCNPs的DMSO中。将10 μL 100 μmol·L-1的适配体加到该分散液中，并在室温下搅拌18 h。将分散液离心并用DMSO洗涤两次以去除未结合的适配体，然后分散在4 mL的Tris缓冲液中。

1.4 cDNA-BHQ1对Apt-UCNPs的荧光猝灭

分别向浓度为0.5 mg·mL-1的Apt-UCNPs溶液中加入不同浓度的cDNA-BHQ1(2.5，5，7.5，10，15 μmol·L-1)，于30 ℃下孵育过夜，然后在980 nm激发光下测试其荧光强度。

1.5 UCNPs-BHQ1检测体系用于检测SDM

分别向分散在Tris缓冲液中的Apt-UCNPs加入不同浓度的SDM(150，300，600，1000 ng·mL-1)，于30 ℃孵育3 h，然后分别加入cDNA-BHQ1，继续孵育3 h，并在980 nm激发光下测试其荧光强度。为了考察Apt-UCNPs对SDM的特异性识别作用，在不改变其他实验条件的情况下，将SDM替换成磺胺醋酰和磺胺吡啶，并在980 nm激发光下测试其荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 UCNPs的表征

2.1.1 UCNPs与PAA-UCNPs的表征

图1 PAA，OA-UCNPs和PAA-UCNPs的红外光谱图a: PAA; b: OA-UCNPs；c: PAA-UCNPsFig.1 FTIR spectra of PAA，OA-UCNPs and PAA-UCNPsa: PAA; b: OA-UCNPs；c: PAA-UCNPs

对OA-UCNPs[图2(a)]和PAA-UCNPs[图2(b)]进行了扫描电镜测试。从图中可以看出，PAA修饰前分散在环己烷中的OA-UCNPs尺寸约为31 nm，而PAA修饰后分散在水溶液中的UCNPs直径约为49 nm。这可能是由于长链的PAA分子体积比油酸分子大，因此包覆在UCNPs表面会使其尺寸增加，PAA的修饰使得UCNPs具有较好的水分散性，良好的水分散性及经过PAA改性后UCNPs表面带有的基团为后续的应用提供了条件。

图2 OA-UCNPs (a)和PAA-UCNPs (b)的扫描电镜图Fig.2 SEM images of OA-UCNPs (a) and PAA-UCNPs (b)

2.1.2 Apt-UCNPs的表征

为了验证适配体已经结合至PAA-UCNPs表面，分别测试了PAA-UCNPs、 Apt-UCNPs和Aptamer在220～400 nm范围内的紫外吸收光谱，结果如图3所示。从图3可以看出，Aptamer在260 nm附近有一个吸收峰，为适配体的特征吸收。而PAA-UCNPs的曲线在该范围内无明显吸收峰，与适配体反应后所得的Apt-UCNPs于260 nm处也出现了较明显的吸收峰，这个峰可以归属于适配体的特征吸收，证明了SDM适配体已偶联到UCNPs上。

2.2 检测机理研究及猝灭条件的优化

Apt-UCNPs用于检测SDM的机理如图4所示。上转换纳米粒子用作产生信号的能量供体，BHQ1用作接收信号的能量受体，适配体用作识别剂。在没有SDM的情况下，Apt-UCNPs表面的适配体链和带有猝灭荧光基团的互补DNA(cDNA)由于碱基互补配对原则互相结合，使BHQ1与Apt-UCNPs的距离很近[13]，从而进行荧光猝灭，而当环境中存在SDM时，适配体优先与其结合，导致cDNA-BHQ1远离Apt-UCNPs，使得Apt-UCNPs的荧光恢复。根据Apt-UCNPs荧光的恢复程度可以用于定量检测SDM的浓度。

图3 Aptamer，PAA-UCNPs和Apt-UCNPs的紫外吸收光谱图Fig.3 UV-Vis absorption spectra of Aptamer, PAA-UCNPs and Apt-UCNPs

图4 Apt-UCNPs用于检测SDM的机理图Fig.4 Schematic diagram of Apt-UCNPs used to detect SDM

为了证实检测方案的可行性，考察了SDM的检测机理，由图5可知Apt-UCNPs在540 nm处有明显发射峰，使其在980 nm激发光下肉眼可见明显绿光，并且发射峰与BHQ1的吸收峰重叠，这表示Apt-UCNPs上的能量通过共振能量转移效应转移到BHQ1上是具有可行性的[14]，而Apt-UCNPs位于660 nm处的发射峰与BHQ1的吸收峰几乎没有重叠，所以BHQ1对660 nm处的荧光发射影响很小。

为使检测条件达到最优，优化了检测体系中猝灭剂的浓度。在相同浓度的Apt-UCNPs中加入不同浓度cDNA-BHQ1，孵育一段时间后，使用980 nm的激发光分别检测其荧光强度，并考察cDNA-BHQ1浓度对Apt-UCNPs荧光猝灭的影响。如图6(a)可知，随着cDNA-BHQ1浓度的增大，Apt-UCNPs位于540 nm处的发射峰强度不断减小，而660 nm处的峰变化不大；反之，Apt-UCNPs的荧光猝灭效率随着cDNA-BHQ1浓度的增加而增加[图6(b)]。当cDNA-BHQ1浓度达到15 μmol·L-1时，荧光强度猝灭达55%，此时猝灭效率的趋势已经逐渐平缓，这可能是由于UCNPs表面的适配体已基本与cDNA-BHQ1结合，因此继续增加cDNA-BHQ1的量对其荧光强度的猝灭效果减小。综合上述原因，选用浓度为15 μmol·L-1的cDNA-BHQ1进行后续的实验。

图5 Apt-UCNPs的荧光光谱和cDNA-BHQ1的吸收光谱Fig.5 Fluorescence spectra of Apt-UCNPs andabsorption spectra of cDNA-BHQ1

图6 不同cDNA-BHQ1浓度下的Apt-UCNPs的 (a)荧光光谱和(b)猝灭效率

2.3 对SDM检测的应用

2.3.1 检测体系用于SDM的识别

考察了传感器检测SDM的灵敏度，其结果如图7(a)所示，在一定的浓度范围内(150～1 000 ng·mL-1)，SDM的浓度与Apt-UCNPs位于540 nm处发射峰的强度为正相关。根据540 nm处Apt-UCNPs荧光强度的恢复程度，得到相对荧光强度(F-F0)/F0与SDM浓度的线性关系，其结果如图7(b)所示，其中F0和F分别代表不存在和存在SDM情况下Apt-UCNPs的荧光强度。从图中可以看出，SDM的浓度与相对荧光强度在150～1 000 ng·mL-1范围内具有较好的线性关系，线性相关系数拟合结果为R2=0.917 28。

图7 不同浓度SDM下Apt-UCNPs的(a)荧光光谱 和(b)标准曲线

2.3.2 特异性分析

选取了与SDM结构相似的磺胺吡啶和磺胺醋酰作为对照实验测试Apt-UCNPs的特异性识别功能，结果如图8所示，尽管磺胺吡啶和磺胺醋酰的浓度达到了500 ng·mL-1，体系中的荧光强度恢复仍然较少，分析认为SDM适配体对SDM的高度亲和力，能阻止Apt-UCNPs与cDNA-BHQ1之间FRET的发生，而对其他结构类似物，适配体的亲和力相对较低，因此荧光强度变化较小，证明了Apt-UCNPs传感器对SDM具有较高的特异性识别作用。

图8 存在不同物质时Apt-UCNPs的荧光光谱Fig.8 Fluorescence spectra of Apt-UCNPs in thepresence of different substances

3 结 论

以适配体功能化上转换纳米粒子(Apt-UCNPs)作为能量供体，以黑洞猝灭剂(BHQ1)作为能量受体，构建了一种基于荧光共振能量转移的特异性检测磺胺二甲氧嘧啶(SDM)的方法。通过FTIR，和SEM对PAA-UCNPs和Apt-UCNPs的结构和性能进行了表征；使用紫外分光光度计对PAA-UCNPs，Apt-UCNPs和Aptamer进行了表征。对猝灭剂BHQ1的浓度进行了优化，结果表明当BHQ1浓度为15 μmol·L-1时，荧光猝灭效率为55%且基本达到平衡，且当SDM 浓度为150～1 000 ng·mL-1时，Apt-UCNPs于540 nm处发射峰的相对荧光强度与SDM浓度线性相关(R2=0.917 28)。为了考察Apt-UCNPs对SDM特异性识别作用，选取与SDM结构相似的磺胺吡啶和磺胺醋酰作为研究对象做对照实验。结果发现，当磺胺吡啶和磺胺醋酰的浓度为500 ng·mL-1时，体系中的荧光强度仍恢复较少，而当浓度为300 ng·mL-1SDM加入到体系中时，Apt-UCNPs的荧光信号增强更多，说明Apt-UCNPs检测体系对SDM具有较好的特异性识别作用。