蒲 祥，张喻涵，兰羽秋，杨胜男，胡海鹏，王广途，王晗光，黄乾明

(四川农业大学 理学院，四川 雅安 625014)

目前，我国农业高校开设的有机化学实验多注重于让学生掌握基础实验原理与基本操作技能，有机物制备实验内容涉及1-溴丁烷、乙酸乙酯、乙酰苯胺、1-苯乙醇等类别物质的制备[1-3]。而关于有机物制备的综合性实验项目较少，实验内容设计与农业、食品、医药等行业的科研或生产实际结合不够紧密，不利于农、林、动、医等专业学生在基础实验课程学习期间培养从事行业有机化学研究的兴趣[4]。因此，有必要有计划地将有机化学实验内容进行更新。近年来，现代化测试仪器和新的合成方法不断引入基础有机化学实验教学，实验类型逐步向综合训练型和科学研究型发展[5]。部分师范类和化工类院校相继开发了一些综合性有机化学实验。例如，孙雨辰等[6]在经典重氮偶合实验基础上新增了硝基还原步骤，制备偶氮类化合物；蒋达洪等[7]在经典Robinson增环反应实验基础上增加了水相绿色氧化步骤以制备联苯类化合物。现有有机化学实验教材中未见“一锅法”合成天然成分黄酮醇的实验[1-3]。本实验将羟醛缩合反应与Algar-Flynn-Oyamada(AFO)反应结合，通过实验，既可锻炼学生综合实验操作技能，让学生熟悉AFO反应，并巩固对羟醛缩合反应的理解，又能使学生熟悉该法在黄酮醇类天然成分合成中的应用，有效激发农林院校学生对有机化学实验的学习兴趣。

1 实验背景

黄酮醇是一种天然活性成分，有防治心血管疾病[8]、抗氧化[9]、抗炎[10]等作用。黄酮醇的制备方法现有4种，即苯并呋喃酮重排法(Auwers法)[11]、Baker-Venkataraman重排环合法[12-13]、黄酮DMDO氧化法[14]和查尔酮氧化环化(AFO)法[15]。其中，AFO法操作简便，应用更为广泛。传统的AFO法制备黄酮醇分两步，在碱性溶液中，以苯乙酮和苯甲醛的衍生物为底物，经羟醛缩合制得羟基查尔酮，再将羟基查尔酮氧化环合生成黄酮醇。该两步合成方法产生大量橙酮副产物，黄酮醇产率较低，仅有10%～20%。2012年，Gunduz等[16]对经典的AFO反应作了进一步改进，发展了“一锅法” AFO环合法：在氢氧化钠的甲醇溶液中回流反应3 h，冷却至室温后，再直接加入氢氧化钠溶液、过氧化氢溶液搅拌2～3 h。“一锅”内连续操作合成了黄酮醇及其类似物，产率可达70%以上。2020年，Xiong等[17]对“一锅法”AFO环合法进行再次改进，在四氢吡咯催化下回流搅拌24 h合成黄酮醇，产率可达80%以上，但该方法耗时长，且四氢吡咯具有腐蚀性，在操作过程中存在一定危险性，不利于本科生进行实验操作。因此，笔者最终选择对Gunduz等[16]合成黄酮醇的方法进行改进优化，将其转化为一个综合创新型实验。改进后操作简单安全、反应现象明显、产率高，适合运用于本科实验教学。

2 实验目的

通过黄酮醇的“一锅法”合成，掌握羟醛缩合、氧化成环等反应的实验操作，巩固羟醛缩合机理，熟悉AFO人名反应涉及的环氧化-氧化机理及提高黄酮醇产率的方法；巩固重结晶的纯化原理和实验操作；熟悉黄酮醇的制备，启发学生探究不同黄酮醇衍生物的合成；熟悉反应进程监测、黄酮醇定性鉴别、产品纯度判断，以及运用熔点仪、IR和NMR等对黄酮醇进行结构表征。

3 实验原理

该反应是在碱性条件下，苯甲醛、邻羟基苯乙酮、过氧化氢之间发生的连续羟醛缩合与氧化成环反应。反应过程为苯甲醛与邻羟基苯乙酮先在碱性条件下，先经羟醛缩合反应形成查尔酮中间体。查尔酮中间体不经分离，直接加入过氧化氢及氢氧化钠溶液进行氧化成环反应，终反应液调节pH至6～7。再加入冰水使黄酮醇充分析出，减压抽滤、蒸馏水洗涤4～5次，所得固体充分干燥后用乙醇重结晶即得黄酮醇。合成路线如图1所示。

4 试剂与仪器

苯甲醛(AR)、邻羟基苯乙酮(99%)、黄酮醇(>98%)标品，购于上海阿拉丁股份有限公司。石油醚(AR)、甲醇(AR)、乙醇(AR)、30%过氧化氢(AR)、乙酸乙酯(AR)、氢氧化钠(片状，AR)，购于成都科隆化学品有限公司。薄层色谱硅胶板GF254，购于青岛海洋化工。

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器)、FA2004C电子天平(上海佑科仪器仪表)、SHZ-D(Ⅲ)循环水真空泵(巩义市予华仪器)、ZF-1型三用紫外分析仪(江苏海门市其林贝尔仪器制造)、F80A斯科茨曼制冰机(斯科茨曼制冰系统(上海)有限公司)、DHG-9101电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器)、SGWR X-4B 显微熔点仪(上海仪电物理光学仪器)、8400S傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津)、AscendTM 600 MHz核磁共振仪(德国Bruker)、Agilent Infinity Lab液质联用仪(美国安捷伦)。

5 实验操作步骤

5.1 羟醛缩合制备查尔酮

将 0.8 g 氢氧化钠固体、60 mL 甲醇、1.2 mL 邻羟基苯乙酮、1.5 mL 苯甲醛，依次加入 250 mL 圆底烧瓶，混合均匀得淡黄色液体。放入磁力搅拌子，将圆底烧瓶置于磁力搅拌器中，75 ℃ 搅拌回流至溶液颜色变为鲜红色，可用薄层色谱法(TLC)监测反应进程(约 3.5 h)。

5.2 AFO反应合成黄酮醇

将5.1得到的反应液冷却至室温后加入 1 mol/L 氢氧化钠溶液 60 mL，再加入30%过氧化氢 4.8 mL，10 ℃ 下搅拌反应约 2.5 h。用TLC法监测反应进程，反应完成即得鲜黄色反应液，随后向瓶内滴加盐酸溶液(1.2 mol/L)调节终反应液的pH至6～7。向调好pH的反应液中倒入 30 mL 冰水，搅拌均匀，使黄酮醇充分析出；减压抽滤，并用蒸馏水洗涤4～5次，充分除盐，得黄色固体，并置于烘箱中 40 ℃ 干燥，得黄酮醇粗品 1.7674 g，产率为74%。

5.3 黄酮醇的精制

将黄酮醇粗品转移至洁净的 250 mL 锥形瓶中，逐次向瓶中加入 10 mL 无水乙醇， 80 ℃ 水浴加热，并充分振摇。若乙醇加热至沸腾仍有未溶物时，继续加入 10 mL 无水乙醇并加热充分振摇溶解。如此重复上述操作，待圆底烧瓶中黄酮醇完全溶解后，补加约 15 mL 无水乙醇(无水乙醇总用量约 75 mL)。趁热过滤除去不溶杂质，将滤液趁热转移至洁净的 250 mL 锥形瓶中，冰浴冷却，待晶体析出完全后减压抽滤；用少量冷乙醇洗涤，所得黄酮醇置 40 ℃ 恒温烘箱中干燥至恒重，即得精制黄酮醇 1.2018 g，收率为68%。实验流程与典型实验现象如图2所示。

6 结果与讨论

6.1 黄酮醇合成过程分析

6.1.1 羟醛缩合反应试剂用量的确定

第一步反应中，原料苯甲醛没有α-H，在浓碱条件下，易发生Cannizzaro副反应(如图3)。因此为提高查尔酮的产率，在第一步的反应试剂用量上应考虑两方面：一是苯甲醛的用量，二是氢氧化钠的用量。由于苯甲醛会发生Cannizzaro副反应导致原料损失。为尽量减少邻羟基苯乙酮的自身缩合，使邻羟基苯乙酮与苯甲醛充分反应，应适当增加苯甲醛的用量；同时为尽量减少Cannizzaro副反应的发生，还应控制氢氧化钠的用量，避免反应体系pH过高，产生大量苯甲酸钠、苯甲醇等副产物。针对氢氧化钠固体的用量，设计了第一步羟醛缩合反应的底物与碱的三组用量比，分别为：n(苯甲醛)∶n(邻羟基苯乙酮)∶n(氢氧化钠)=1.5∶1∶3、1.5∶1∶2、1.5∶1∶1(对应的初始pH分别为 13～14、12～13、11～12)，随后进行条件实验。通过TLC法比较所得查尔酮的产量与纯度。最终确定苯甲醛、邻羟基苯乙酮和氢氧化钠最佳物质的量比为1.5∶1∶2(pH为12～13)。

6.1.2 AFO反应温度的确定

根据AFO反应的环氧化-氧化机理(如图4)，反应温度过高可能会导致橙酮等副产物的生成[18]，应将AFO反应的温度控制在室温(25 ℃)以下。综合考虑实验成本及可操作性，选择了0、10、15、20、25 ℃ 5个温度进行第二步AFO反应的温度条件实验。比较所得黄酮醇的产量、利用TLC法比较黄酮醇的纯度，探究AFO反应的最佳反应温度。最终确定第二步AFO反应的最佳反应温度为 10 ℃。

6.1.3 AFO反应过氧化氢用量的确定

第二步AFO反应中过氧化氢的用量十分关键，若过氧化氢用量过少，则导致氧化不充分，出现二氢黄酮醇等副产物；用量过多则导致氧化过度，也会增加副产物，影响最终所得黄酮醇的产率和纯度。在AFO反应 10 ℃ 的最佳反应温度下，设计了30%过氧化氢的3组用量，分别为 4.8 mL(0.047 mol)、5.4 mL(0.053 mol)、6.0 mL(0.059 mol)，随后进行条件实验。比较所得黄酮醇的产量、利用TLC法比较产品的纯度，探究第二步反应过氧化氢的最佳用量。最终确定第二步AFO反应过氧化氢(30%过氧化氢)的最佳用量为 4.8 mL。

6.1.4 黄酮醇的重结晶

终反应液经pH调节、产物析出、减压抽滤、蒸馏水洗涤后所得的黄酮醇粗品中可能存在的杂质有副产物2’-羟基查尔酮、二氢黄酮醇、橙酮等。根据极性由大到小的顺序选择了6种常见溶剂(见表1)。分别将上述6种溶剂作为 0.1 g 粗产品(均来自于同一次制备的黄酮醇粗产品)的重结晶溶剂。观察粗产品在6种溶剂中的溶解情况、冷却后的析晶情况，并利用TLC法进行黄酮醇重结晶产品及其纯度的鉴定，最后计算黄酮醇收率。实验表明，乙醇是黄酮醇的最佳重结晶试剂，见表1。重结晶溶剂的用量也对产品的收率和纯度起着重要作用。经反复实验，确定在粗产品与乙醇的质量体积比为1 g∶45 mL，且同时进行 80 ℃ 水浴加热和搅拌操作时，粗产品能较好地溶解，冷却后析出的晶体最多，纯度较高。

6.2 黄酮醇结构分析和表征

6.2.1 熔点、TLC及LC-MS

本实验制备黄酮醇样品的熔点为169～170 ℃(文献值：170～171 ℃)。当使用石油醚-乙酸乙酯(体积比6∶1)进行TLC时，其与黄酮醇标准品的TLC对比结果如图5。黄酮醇样品与标准品Rf值相同，且无杂质点。LC-MS分析结果显示，样品质荷比为[M+H]+m/z=239.1、[M+Na]+m/z=261.1(如图5b)，与标准品(如图5a)一致。以上结果均表明在上述实验条件下成功制备了黄酮醇。

6.2.2 FT-IR

本实验制备的黄酮醇的IR光谱如图6所示。其中，3300～3100 cm-1处为黄酮醇C环3位羟基的νO-H吸收峰，1608 cm-1处为黄酮醇C环上的νC=O吸收峰，758 cm-1、688 cm-1处为单取代及邻位双取代苯环(B、A环)上的δC-H吸收峰，1560 cm-1、1479 cm-1为苯环νC=C吸收峰，1130 cm-1、897 cm-1处为黄酮醇C环1位的νasC-O-C、νsC-O-C吸收峰，1211 cm-1处为黄酮醇C环3位的νC-O吸收峰。

6.2.3 NMR

本实验制备所得的黄酮醇核磁共振结果如图7所示。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：8.46(m，3H，a、e、i)，7.91(ddd，1H，c)，7.80(dd，1H，d)，7.78～7.71(m，2H，f、h)，7.71～7.65(m，1H，g)，7.62(ddd，1H，b)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：173.64(c)，155.58(h)，145.04(a)，138.61(b)，133.79(f)，131.22(j)，130.34(m)，128.75(n、l)，127.90(k、o)，125.62(d)，124.67(e)，120.78(i)，118.44(g)。结果表明，本法成功制备了纯度理想的黄酮醇。

7 结语

本实验将羟醛缩合反应与AFO氧化环化反应结合，不经中间体分离，直接“一锅法”合成天然活性成分黄酮醇，实验耗时7～8 h，黄酮醇平均产率可达74%。该实验既让学生巩固了有机化学基本实验操作技能，加深其对羟醛缩合与氧化环化反应机理的认识，并熟悉该法在天然活性成分黄酮醇制备过程中的实际运用；本实验的原料苯甲醛、邻羟基苯乙酮，重结晶溶剂乙醇等都是本科实验常用的原料，低毒易得，价格便宜；本实验还具有操作简便，变色现象明显，产率较高等的优点，易于激发学生实验兴趣。该实验设计教学学时8学时，适于将其开设为农林院校有机化学实验的综合创新实验。此外，还可以基于本实验的反应原理进行底物拓展，引导学生设计并制备新型黄酮醇衍生物，提升学生的综合实验能力。