郑 婕 庄远航 郭梓琪 许 艺 钟俊杰 黄维峰 胡 芳 李海渤 雷建军，2* 吴 昊*

（1 韶关学院英东生物与农业学院，广东韶关 512005；2 华南农业大学园艺学院，广东广州 510642；3 广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室，广东韶关 512005）

辣椒（spp.）是茄科辣椒属的重要蔬菜作物，也是我国栽培面积最大的蔬菜作物（邹学校 等，2020；王立浩 等，2021）。广东省作为我国重要的南菜北运基地，辣椒年种植面积达9.92 万hm（李颖 等，2020）。随着广东省农业产业结构调整以及脱贫攻坚的大力开展，粤北地区辣椒种植面积逐年增大，辣椒病害发生也日趋严重。辣椒炭疽病是一种世界性的辣椒病害，每年全球因炭疽病导致辣椒减产约50%，热带或亚热带地区受到的影响最为严重（Than et al.，2008；Ridzuan et al.，2018）。印度每年因炭疽病造成辣椒减产10%～54%，越南因炭疽病导致辣椒产量下降最高可达80%（Saxena et al.，2016）。辣椒炭疽病在我国可导致辣椒减产30%～40%，严重时减产50%左右（林清 等，2005；周黛媛 等，2022），广东省地处亚热带和热带，是辣椒炭疽病的高发地区。

辣椒炭疽病的典型症状是在病果和病叶上出现同心轮纹状病斑，病原菌不仅为害生长期的辣椒果实和茎叶，还能在采后贮运过程中持续造成果实腐烂，严重影响干鲜椒的产量和品质。引起辣椒炭疽病的病原菌属于半知菌亚门炭疽菌属（），该属种类繁多且类别复杂，常见优势种有（异名）、（曾被鉴定为）以及（曾被鉴定为）（Mongkolporn，2019）。我国已报道的辣椒炭疽病致病菌至少有15种，且不同地区的优势种差异较大（Diao et al.，2017）。由于不同的炭疽病菌对杀菌剂的敏感性存在差异（满益龙 等，2016），而杀菌剂的不合理施用不仅会导致农药浪费和环境污染，还可能导致病原菌出现耐药性甚至抗药性。因此有必要针对辣椒主要产区的炭疽病菌进行分离和鉴定，为指导田间高效防治药剂的施用奠定基础。为此，本试验对采集自广东省韶关市南雄市辣椒种植区的辣椒炭疽病病果进行病原菌分离纯化和微生物学、分子生物学方法鉴定，并利用12 种杀菌剂进行室内毒力测定，以期为粤北地区辣椒炭疽病防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离纯化

2020 年10 月于广东省韶关市南雄市湖口镇辣椒基地，采集疑似感染炭疽病的朝天椒果实样本。将获得的果实样本带回实验室，通过组织分离法将病果的病健交界处剪成5 mm × 5 mm 小块，用0.1%HgCl消毒1 min，灭菌ddHO 冲洗5～6 次后用无菌吸水纸吸干水分，接种到番茄燕麦琼脂（tomato oatmeal agar，TOA）培养基中进行分离培养及菌落纯化。TOA 培养基：番茄汁150 mL、CaCO0.6 g、燕麦片40 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L，121 ℃灭菌20 min。

1.2 病原菌孢子悬液制备

用打孔器在TOA 培养基上培养1 周的菌落边缘打取直径0.3 cm 的小菌块，取3～5 个菌块置于50 mL 液体TOA 培养基中，在28 ℃恒温摇床中130 r·min培养72 h。在超净工作台中将培养好的菌块转移至新的无菌培养皿中，加入灭菌的蒸馏水，28 ℃光照条件下培养12 h。之后去除培养皿中的蒸馏水，置于28 ℃黑暗条件下处理12 h。待孢子囊成熟后，将菌块转移至无菌试管中，加5 mL 灭菌蒸馏水，利用涡旋仪振荡2 min 使孢子囊脱落。孢子悬液用于显微观察和针刺接种。

1.3 病原菌的致病力测定

为了确定病原菌致病性，依据柯赫氏法则将病原分离物重新接种朝天椒，发病后再进行分离鉴定（方中达，1998）。取新鲜健康的朝天椒绿果，对果实表面进行消毒，采用针刺接种法将5 μL 病菌孢子悬浮液（孢子浓度为1 × 10个·mL）接种至果实表面，对照组接种等量灭菌ddHO，于28 ℃恒温培养箱中培养，湿度80%，每个处理进行3 次生物学重复。

1.4 病原菌的形态学鉴定

观察并记录病原菌菌落在TOA 培养基上的形态、大小及颜色等特征。诱导病菌的孢子悬浮液并进行显微制片，通过显微镜观察并记录病原菌的分生孢子形态特征。

1.5 病原菌的分子生物学鉴定

利用真菌基因组DNA 快速抽提试剂盒〔生工生物工程（上海）股份有限公司，B518229〕，对病原菌的基因组DNA 进行抽提和纯化。对病原菌的核糖体转录间隔序列（internal transcribed spaces，ITS）、β-微管蛋白基因（β-tubulingene，）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene，）、几 丁质合成酶A 基因（chitin synthase A gene，）和肌动蛋白基因（actin gene，）进行PCR 扩增，所用引物见表1。PCR 的反应体系包括病原菌基因组DNA 100 ng，引物4 mmol·L，KOD 酶0.4 μL，2× KOD buffer 10 μL，dNTP 4 mmol·L，ddHO 补足至20 μL。PCR 程序设置为：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，68 ℃延伸30 s；共35 个循环。PCR 产物通过1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将扩增长度符合预期的PCR产物连接到pEASY-blunt zero 载体上，对阳性克隆进行测序及进一步的序列分析。

表1 病原菌分子鉴定相关基因克隆所用引物

1.6 多基因的系统发育树分析

将、、、和基 因片段的测序结果在GenBank 中进行BLAST 序列比对，利用数据库中的炭疽菌属模式菌株的、、、和基因序列作为参考序列（Diao et al.，2017）。将上述基因序列进行串联分析，利用Geneious v4.8.3 软件对组合数据集进行邻接（neighbor-joining，NJ）系统聚类分析，通过自展法（bootstrap analysis）对系统发育树进化枝的稳定性进行评估，重复1 000 次。本试验涉及的炭疽菌属模式菌株的相关信息详见表2。

表2 用于系统发育树分析的炭疽菌菌株

1.7 药剂室内毒力测定

供试12 种常用杀菌剂购买于本地市场（表3）。先将12 种杀菌剂配制成待测母液，然后按比例加至TOA 培养基中：在无菌条件下，按10、100、1 000 μg·mL的终浓度将所需母液量加入培养基中，空白对照为加入等量无菌水的培养基。用接种针挑取直径为3 mm 的菌块接种至培养基的中央，28 ℃培养7 d，每个浓度梯度进行3 次生物学重复。采用“十”字交叉法对菌落直径进行测量并记录数据。将抑菌效果较好的6 种有效药剂挑出进行第2轮试验，其中咪鲜胺、苯甲·丙环唑和甲基硫菌灵浓度梯度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg·mL，腈菌唑、唑醚·代森联和醚菌酯浓度梯度为5、10、20、40、80 μg·mL。采用生长速率法测定和计算不同药剂的抑菌率。根据各杀菌剂浓度对数值及对应的抑菌率作回归分析，计算各杀菌剂的毒力回归方程（=+）、抑菌有效中浓度（EC）及相关系数（）。

表3 供试药剂及生产厂家

抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-接种菌饼直径）× 100%

1.8 数据分析

采用Microsoft Excel 2010 软件进行数据处理和作图，利用DPS v7.05 软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 南雄朝天椒炭疽病的危害及病原菌的分离

辣椒炭疽病多发生于每年7 月初至9 月中旬，正是成熟辣椒大量采收和贮运的关键时期。2020年，广东省韶关市南雄市朝天椒种植区大面积暴发辣椒炭疽病，严重地块的病果率高达80%。该病原菌主要为害红熟后的辣椒果实，并在采后贮运过程中持续造成果实腐烂。发病初期，被害果实出现褐色不规则病斑。贮运过程中密封的湿热环境加速病害的蔓延，病斑上出现橘黄色的孢子团。发病后期，病斑扩散至整个果实，病果失水干枯并发生脱落（图1-a）。

图1 南雄辣椒炭疽病发病症状及病原菌形态

通过组织分离法，在TOA 培养基上分离到白色的真菌菌落（图1-b）。对分离得到的病原菌进行纯化，菌落在培养基上呈圆形，菌丝呈白色绒状，后期逐渐变为灰色，并有同心环纹（图1-c）。分生孢子为无色单胞，形状为长棒状，长轴为8～17 μm，短轴为4～6 μm（图1-d）。

2.2 病原菌的致病性测定

利用针刺接种法对新鲜的朝天椒绿果进行炭疽病菌孢子悬液的接种，2 d 后接种位置出现炭疽病病斑，病情发展迅速。接种后第6 天，炭疽病病斑凹陷，呈长椭圆形，直径可达10～15 mm，中央产生大量橙色粘稠的孢子团，外周呈褐色；对照未出现病斑，针刺位置可清晰辨认（图2）。根据柯赫氏法则，将本次试验的发病组织重新进行组织分离，得到的病原菌与之前分离的原始病原菌一致，确定该菌为南雄朝天椒炭疽病的致病菌，并将该菌株命名为NX-1。

图2 辣椒炭疽病病原菌的致病性测定结果

2.3 病原菌的分子生物学鉴定

对南雄辣椒炭疽病菌NX-1 的、、、和基因进行PCR 扩增，获得长度分别为558、759、248、291 bp 和 250 bp的DNA 序列（图3）。对上述基因片段进行测序，测序结果通过多基因的系统发育树进行分析，结果表明病原菌NX-1 与炭疽菌模式菌株CBS 120708 为一个进化支（图4）。结合NX-1 的形态学特征和多基因系统发育树分析结果，将南雄辣椒炭疽病菌NX-1 鉴定为炭疽菌。

图3 NX-1 分子鉴定相关基因的PCR 扩增

图4 炭疽病菌NX-1 的多基因系统发育树分析结果

2.4 12 种药剂对辣椒炭疽病菌的抑菌效果鉴定

通过10、100、1 000 μg·mL3 个浓度梯度的12 种药剂对炭疽病进行初步的抑菌效果鉴定，结果表明：咪唑类和三唑类的单剂（咪鲜胺和腈菌唑）或复配剂（苯甲·丙环唑）均表现出良好的抑菌效果；取代苯基类的甲基硫菌灵抑菌效果较好，但百菌清效果一般；甲氧基丙烯酸酯类的单剂（醚菌酯）或复配剂（唑醚·代森联）也表现出较好的抑菌效果；春雷·王铜和甲霜·噁霉灵这两种复配剂只能在高浓度条件下具有抑菌作用；噁霉·络氨铜的抑菌效果较差；烯酰吗啉和噻菌酮几乎没有抑菌作用（图5、6）。

图5 不同浓度杀菌剂对炭疽病菌NX-1 菌丝生长的抑制作用

图6 不同浓度杀菌剂对炭疽病菌NX-1 的抑制率

2.5 6 种有效药剂对辣椒炭疽病菌的室内毒力测定

采用咪鲜胺、苯甲·丙环唑、甲基硫菌灵、腈菌唑、唑醚·代森联和醚菌酯6 种抑菌效果较好的杀菌剂对NX-1 进一步进行室内毒力测定，结果表明，6 种药剂均能不同程度地抑制炭疽病菌菌丝的生长，其抑菌作用由强到弱依次为：咪鲜胺＞苯甲·丙环唑＞甲基硫菌灵＞腈菌唑＞唑醚·代森联＞醚菌酯（图7）。咪鲜胺和苯甲·丙环唑的EC均在1 μg·mL以内，分别为0.019 6 μg·mL和0.282 8 μg·mL，抑菌效果较强；其次是甲基硫菌灵和腈菌唑，EC分别为1.694 6 μg·mL和7.475 6 μg·mL；唑醚·代森联和醚菌酯的EC较高，分别为16.130 8 μg·mL和19.942 8 μg·mL（表4）。

图7 6 种有效药剂对炭疽病菌NX-1 菌丝生长的抑制作用

表4 6 种有效杀菌剂对炭疽病菌NX-1 的室内毒力测定

3 讨论与结论

近年来，广东省南雄市的辣椒种植逐渐成为了具有地方特色的北运蔬菜产业。然而，辣椒的炭疽病害也随着南雄辣椒种植面积的扩大而日趋严重。本试验从南雄市湖口镇辣椒基地采集疑似辣椒炭疽病的自然发病朝天椒果实，获得分离纯化的辣椒炭疽病病原菌，通过致病性测定、微生物形态学分析和分子生物学研究方法确定南雄朝天椒炭疽病病原菌的种类为。近年来，分子生物学在真菌的分类研究中发挥了很大作用，序列分析、多基因的系统发育树分析等方法被广泛应用（Marin-Felix et al.，2017）。基因是分子检测中最常用的靶基因，但该基因没有足够的变异位点用以区分所有的菌种（Innis et al.，1991）。本试验使用的多基因系统发育树分析是基于、、、和5 个基因的串联分析，该方法在亲缘关系较近、外形相似的真菌间的分析比较与种类鉴定中较单基因序列分析更具优势。

通过对12 种杀菌剂的抑菌效果鉴定和室内毒力测定，表明咪鲜胺、苯甲·丙环唑、甲基硫菌灵、腈菌唑、唑醚·代森联和醚菌酯均对南雄辣椒炭疽病菌表现出不同程度的抑制作用。从EC来看，咪鲜胺和苯甲·丙环唑的抑菌作用最强，其EC分别为0.019 6 μg·mL和0.282 8 μg·mL。因此，咪鲜胺和苯甲·丙环唑均可用于南雄辣椒炭疽病的防治，可将咪鲜胺作为首选杀菌剂，或二者交替使用。此外，由于田间环境影响因素较多，杀菌剂的室内毒力与田间实际防治效果可能有所差异，今后将进一步测定咪鲜胺和苯甲·丙环唑在大田中对辣椒炭疽病菌的影响，以期在实际的辣椒生产中指导企业和农民在辣椒炭疽病害管理过程中科学、高效用药，降低生产成本和农药施用量，为食品安全和生态环境提供保障。