张仲敏，连振清，刘丽晶，杜铖豪，王超

(1.广西中医药大学 药学院，广西 南宁，530200；2.广西中医药大学 瑞康临床医学院，广西 南宁，530001;3. 广西中医药大学 基础医学院，广西 南宁，530200；4.广西中医药大学 广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室，广西 南宁，530200)

酸藤子为紫金牛科植物酸藤子Embelialaeta(L.) Mez.的干燥根，又名青龙钻、酸藤木、挖不尽、入地龙、酸藤果，在我国东南部至西南部均有分布，全年均可采，切段、晒干入药。广西瑶药有“五虎、九牛、十八钻、七十二风”等说法，其中酸藤子就是七十二风之一的风打相兼药，其瑶药名为酸吉风，味酸、涩，平，归心、脾、肝经。《中国现代瑶药》《中华本草》均记载了酸藤子具有清热解毒、活血散瘀、祛风收敛、健脾安胎的功效，主要用于口腔炎、咽喉炎、慢性肠炎、风湿痛、类风湿性关节炎等炎症疾病[1-2]。现代研究表明，酸藤子中富含糖苷类、有机酸、黄酮类、多酚类、萜类化合物[3]，这些成分可能是酸藤子药理作用的重要效应成分，由于目前对酸藤子的效应物质研究较少，严重制约着酸藤子的开发利用。

网络药理学通过系统生物学、基因组学、蛋白组学等多学科整合以发现药物作用的靶点和分子机制。其整体性和系统性与中药多成分、整体性的观点是相似的，近年来被广泛应用于中药药效基础、作用机制、中药毒性等研究[4-7]。分子对接技术可以针对已知结构的靶蛋白进行分子间相互作用识别并预测受体-配体复合物的结构[5,8-9]。本文利用网络药理学分析瑶药酸藤子活性成分抗炎的靶点及相关通路，并运用分子对接技术分析核心成分与靶点之间的结合能力，为瑶药酸藤子的开发利用提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 收集炎症相关靶点

利用Gene Cards数据库(https://www.genecards.org/)，NCBI的Gene数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)，CTD数据库(http://ctdbase.org/)分别输入“inflammation”关键词进行检索。其中，Gene Cards数据库和CTD数据库选取分值靠前的5 000条数据进行分析。3个数据库检索结果取交集并用Uniprot ID 进行标准化获得炎症相关靶点。

1.2 收集活性成分相关靶点

中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP, https://www.tcmsp-e.com/)中没有收录酸藤子的药物信息，通过查阅文献获取酸藤子的活性成分[3]。在TCMSP数据库中检索活性成分名称，并利用口服利用度(OB)≥30%和药物相似性(DL)≥0.18为条件筛选[5,9]，符合筛选条件的活性成分纳入研究。将筛选到的活性成分在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索并找到对应的SMILES编号，利用SMILES编号在Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)中对活性成分的靶点进行检索，并对检索的结果进行去重即为酸藤子活性成分的靶点。

1.3 筛选活性成分与炎症共有靶点

将炎症相关靶点与酸藤子活性成分靶点取交集制作韦恩图得到酸藤子抗炎的潜在靶点。用Cytoscape 3.8.2软件构建酸藤子活性成分-炎症潜在靶点相互作用网络。

1.4 蛋白质相互作用网络构建

利用STRING(https://www.string-db.org/)数据库构建酸藤子抗炎潜在靶点蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络图。选择“Multiple proteins”，然后将蛋白质名称录入检索框，物种选择“Homo sapiens”，可信度选择高可信度，其他参数为系统默认，网络图构建完成之后，下载TSV文件，并用该文件在Cytoscape 3.8.2软件中进行可视化分析。

1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

利用在线分析工具(https://www.xiantao.love/products)进行富集分析、统计分析与可视化展示。

1.6 成分-靶点分子对接

在PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中检索靶点分子的PDB格式文件， 在TCMSP数据库中下载活性成分结构的mol2格式文件。用Pymol 软件去除靶点的配体和多聚体。用Autodock 4.2软件利用以上文件进行分子对接，将对接结果用Pymol 软件可视化处理并输出。

2 结果

2.1 炎症靶点的收集

在Gene数据库中检索到2 099条炎症相关基因。将3个数据库检索到的基因数据取交集并用Uniprot ID 进行标准化，得到炎症靶点1 193个。

2.2 活性成分及作用靶点的确定

通过文献报道，根据OB和DL值筛选出酸藤子的活性成分有7个(表1)。通过Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测，去重之后获取267个靶点。

表1 酸藤子7个活性成分

2.3 活性成分与炎症共有靶点的筛选

将炎症靶点与活性成分靶点取交集制作韦恩图(图1)，获得123个酸藤子活性成分与炎症共有的靶点。

图1 酸藤子活性成分靶点与炎症靶点的韦恩图Fig.1 Venn diagram of active component targets of Embelia laeta and inflammation targets

2.4 活性成分-炎症潜在靶点网络构建

如图2所示，利用 Cytoscape 3.8.2软件将7个活性成分与123个潜在靶点构建酸藤子活性成分-炎症潜在靶点网络图。该图有130个节点，280条边。Degree值的大小反应节点之间的关联个数，图中活性成分圆圈由小到大表示degree值由低到高。排名前3位的活性成分分别为蒽贝素(MOL005235)、金圣草黄素(MOL003044)和槲皮素(MOL000098)。

图2 酸藤子干预炎症的“成分-炎症潜在靶点”网络Fig.2 “Components-potential targets of inflammation” network of Embelia laeta in the intervention of inflammation

2.5 PPI网络的构建

将酸藤子活性成分与炎症共有的123个靶点输入STRING数据库构建PPI网络，并通过Cytoscape进行可视化，结果见图3。该网络涉及111个节点，442条边。节点表示靶点，边表示靶点之间相互作用关系。节点的大小和颜色深浅与degree值相关。节点越大、颜色越深，degree值就越大。Degree值评分前10位的靶点基因分别是IL6、HSP90AA1、AKT1、SRC、MAPK3、PIK3CA、EGFR、ESR1、PTGS2、MMP9。

图3 酸藤子干预炎症相关靶点的PPI网络Fig.3 PPI network of targets of Embelia laeta in intervention of inflammation

2.6 GO和KEGG富集分析

将酸藤子干预炎症的123个靶标基因利用生物信息在线分析工具进行富集分析。利用P.adjust<0.05进行筛选。富集结果显示,GO中生物过程有1 820个；细胞组分有55个；分子功能有142个。KEGG有114条。GO 3个类别按照P值评分前5条见表2。酸藤子干预炎症的靶基因主要涉及氧化应激反应、类固醇激素反应、对活性氧反应等生物过程；包含膜阀、膜区、囊腔等细胞组分；参与核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体等分子功能。根据P.adjust排序，KEGG排名前20条通路制作气泡图(图4)。酸藤子干预炎症的靶基因主要涉及PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、肿瘤中的microRNAs(microRNAs in cancer )、肿瘤中的蛋白多糖(proteoglycans in cancer)等信号通路。

表2 酸藤子干预炎症靶点的GO富集过程分析

图4 酸藤子干预炎症靶点的KEGG代谢通路富集分析Fig.4 Enriched KEGG pathways of targets from Embelia laeta intervention in inflammation

2.7 活性成分与靶蛋白的分子对接

选取在活性成分-炎症潜在靶点网络图中degree值排名前3的活性成分(蒽贝素、金圣草黄素和槲皮素)以及PPI网络图中degree值排名前3的基因分别进行分子对接。对接结果见表3。结合能<0，表示在自然状态下可以结合，结合能越低，提示结合活性越好。分子对接结果可视化见图5。结果显示，酸藤子的3种活性成分蒽贝素、金圣草黄素和槲皮素与IL-6、HSP90AA1和AKT1均能够有效结合，最低结合能均<-4.5 kcal/mol。其中金圣草黄素与3个靶蛋白的结合能均为最小值。

表3 活性成分与靶点分子对接结合能

图5 活性成分与靶点的分子对接模式图Fig.5 Molecular docking patterns of active components to target molecules

3 讨论

酸藤子在中国南方地区资源丰富，作为瑶族的传统应用药物，在口腔溃疡、咽喉肿痛、肠炎、风湿、类风湿性关节炎、皮炎等方面显示出良好的疗效[10]，酸藤子具有丰富的化学成分，但是目前还没有进行全面的系统性研究[3,11-12]，尤其是关于酸藤子效应物质及相关的药理作用研究仍然不足。本研究利用网络药理学技术筛选出7种酸藤子的活性成分，分别是蒽贝素、槲皮素、金圣草黄素、β-谷甾醇、豆甾醇、豆甾-4-烯-3,6-二酮、山柰酚，以及123个炎症相关的靶标，并构建了活性成分-炎症潜在靶标网络图；酸藤子干预炎症相关靶点的PPI网络，筛选到评分前10位的靶点基因分别是IL6、HSP90AA1、AKT1、SRC、MAPK3、PIK3CA、EGFR、ESR1、PTGS2、MMP9，显示出酸藤子干预炎症具有多成分、多靶点的特点。预测该10个靶点在酸藤子抗炎过程中处于核心地位。本研究继续选择评分前3位的活性成分，即蒽贝素、金圣草黄素、槲皮素与3个炎症靶点，即IL6、HSP90AA1、AKT1分别进行分子对接，结果也显示这些活性成分与3个靶蛋白均能有效结合。

已有研究发现，蒽贝素、槲皮素和金圣草黄素3种成分能够干预多种疾病，有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等重要活性。例如余纳等[13]研究发现蒽贝素能够降低血清中的IL-6和 IL-17A炎症因子，缓解关节炎症状，有抗炎作用。KUMAR等[14]研究发现蒽贝素能够降低炎症因子，减轻炎症损伤。张佳凤等[15]研究发现槲皮素可以通过抑制Akt/mTOR通路干预疾病。而且槲皮素本身就可以作为膳食补充剂，对多种疾病有预防和治疗作用，表现出抗氧化、抗炎、提高免疫力等活性[16]。金圣草黄素是一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、化学预防和免疫调节等多种生物学特性。YOON等[17]研究发现金圣草黄素可以通过NF-κB、AP-1、PI3K/Akt、MAPK信号通路改善TLR4介导的炎症反应。WU等[18]发现金圣草黄素可以通过抑制JAK2/STAT3和IκB/p65 NF-κB信号通路而起到抗炎作用。以上这些研究也提示蒽贝素、槲皮素和金圣草黄素以及相关靶蛋白可能为酸藤子抗炎的物质基础与作用机制。

进一步对123个炎症靶点进行GO和KEGG富集分析。GO分析结果发现，酸藤子参与抗炎的靶标涉及多种生物过程、细胞组分和分子功能，主要涉及氧化应激反应、类固醇激素和活性氧反应，包括核受体活性、转录因子活性，类固醇激素受体、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等。KEGG富集分析发现酸藤子抗炎的靶基因主要涉及PI3K-Akt信号通路、肿瘤中的microRNA、肿瘤中的蛋白多糖等信号通路、花生四烯酸代谢、IL-17信号通路等。结合PPI网络构建图，评分前10位的靶点基因均参与以上代谢途径。本研究蒽贝素、槲皮素和金圣草黄素3种活性成分参与的信号通路的结果与GO与KEGG富集通路的分析结果[13-18]也是一致的。以上结果进一步提示，酸藤子干预炎症是多途径、多通路的方式。其中包含IL6、HSP90AA1、AKT1在内评分前10位的靶标参与的PI3K-Akt信号通路、肿瘤中的microRNA途径、肿瘤中的蛋白多糖等信号通路等途径可能是酸藤子干预炎症的潜在作用机制。

综上所述，本研究基于网络药理学对瑶药酸藤子抗炎的活性成分、主要靶点、信号通路进行了分析，并结合分子对接技术探讨了活性成分与靶标结合的可能性，为下一步实验研究酸藤子抗炎的机制提供了理论依据。网络药理学和分子对接技术有一定的局限性，以上结果仍需要通过实验进行验证。