葛思彤，李 琦，贾 睿，刘 伟，刘美宏，刘回民，郑明珠，蔡 丹，刘景圣

（吉林农业大学食品科学与工程学院，小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林 长春 130118）

Pickering乳液是一种利用固体颗粒代替表面活性剂对于油水界面进行稳定而形成的乳液，与传统乳液相比，其成本低、对环境污染小。由于固体颗粒之间存在静电斥力，使得液滴之间彼此保持一定的距离，能够与油水界面形成稳定的三维网状结构。此外，固体颗粒在油水界面的吸附行为是不可逆的，从而使得Pickering乳液的稳定性良好，且具有抗Ostwald熟化的能力。玉米醇溶蛋白（Zein）基固体颗粒是近年来稳定Pickering乳液较为常见的原料，Zhang Wei等利用Zein-果胶复合纳米颗粒稳定的Pickering乳液，在高油量分数（=0.6）下乳液呈现出长期贮藏稳定性。此外，Zein/壳聚糖复合颗粒也被证实是有效的Pickering乳液乳化稳定剂，形成的乳液在9 个月的贮藏期间具有较强的抗絮凝能力。Liu Xiao等利用Zein和麦醇溶蛋白形成的复合颗粒作为Pickering乳液的稳定剂，颗粒可以在油水界面形成难以被破坏的界面层，使得乳液具有良好的黏弹性和贮藏稳定性。这些研究表明，Zein基固体颗粒稳定Pickering乳液具有良好的发展前景。

Zein是玉米中的主要贮藏蛋白，具有强疏水性，可以溶于60%～95%的乙醇溶液，具有良好的生物相容性和可降解性。众多学者研究表明，通过Zein的两亲特性及自组装能力可以成功制备纳米颗粒、纳米乳液等生物递送体系，从而实现对于生物活性物质的包埋与递送。目前许多研究利用多糖、多酚、表面活性剂等对Zein进行修饰，以期获得更加稳定的Zein基递送体系。其中，利用多酚对蛋白质进行修饰的研究备受关注。前期研究表明，蛋白质和多酚可以通过非共价方式进行结合，进而改变Zein的功能与结构特性，此时二者之间的作用力主要集中于氢键、疏水键等非共价键，是一种可逆的相互作用。同时多酚的加入也可以在一定程度上抑制贮藏过程中Pickering乳液脂质氧化现象的发生，以期延长乳液的贮藏时间。没食子酸（gallic acid，GA）是白色或者淡黄色的结晶或粉末状物质，广泛应用于食品、药品等行业。根据前期研究，GA具有抗炎、抗肿瘤等作用，同时还可以清除自由基，具有一定的抗氧化活性，属于常见的多酚类物质。同时，GA可以与蛋白质、多糖等物质进行非共价结合。目前，应用醇溶性蛋白质和多酚进行非共价结合的研究较少，多酚的加入对于醇溶性蛋白理化性质的影响有待探究。

本研究利用GA对于醇溶性蛋白质进行修饰，通过非共价结合的方式制备出玉米醇溶蛋白/没食子酸复合纳米颗粒（zein/gallic acid composite nanoparticles，ZGP），对形成纳米颗粒的大小、微观形态、结构、热力学进行表征。进一步利用制备出的纳米颗粒稳定Pickering乳液，并对乳液的液滴大小、Zeta电位、流变学特性以及贮藏期间的氧化稳定性能进行研究，为Zein的综合利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Zein、GA 上海源叶生物科技有限公司；玉米油吉林省长春市沃尔玛超市；去离子水为实验室自制；透析袋（截留分子质量为12～14 kDa） 湖南翊博生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PC-620D磁力搅拌器 美国CORNING公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；FD-1A-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；ZS90粒径分析仪 英国Malvern公司；Sigma300扫描电镜 英国Zeiss公司；VERTEX 70傅里叶变换红外（Fourier transform infrared，FTIR）光谱仪德国Bruker公司；D/MAX2500 X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）仪 日本理学公司；Q2000差示扫描量热（differential scanning calorimeter，DSC）仪、等温滴定量热（isothermal titration calorimetry，ITC）仪美国TA公司；T18高速剪切机 德国IKA公司；MCR流变仪 奥地利安东帕（中国）有限公司；TH2-DT2H7 HiTemp Shaker 上海博彩生物科技有限公司；Fluostar omega酶标仪 德国BMG Labtech公司。

1.3 方法

1.3.1 ZGP的制备

制备质量浓度为2 g/100 mL的Zein-乙醇溶液40 mL（体积分数70%），磁力搅拌2 h后放于4 ℃贮藏过夜，保证Zein充分水合。将GA溶于去离子水中（100 mL），Zein和GA质量比分别为1∶0～1∶0.5，充分搅拌至GA完全溶解。在1 000 r/min条件下将Zein溶液以细流状倒入GA溶液中，并持续搅拌20 min。随后将溶液透析处理12 h，以除去游离的多酚，每2 h更换一次透析液（70%乙醇溶液）。利用旋转蒸发仪去除乙醇和一小部分水溶液（最终蛋白质量浓度为3 g/100 mL）。将制备得到的颗粒溶液放于4 ℃贮存并进行真空冷冻干燥获得固体粉末状颗粒。

1.3.2 ZGP颗粒粒径、多分散指数（polymer dispersity index，PDI）与Zeta电位测定

参考Liang Xiao等的方法，将ZGP溶液稀释20 倍后，在25 ℃、折射率1.330条件下利用ZS90粒径分析仪进行粒径、PDI值及Zeta电位测试。

1.3.3 ZGP微观结构观察

将冷冻干燥后的ZGP固体粉末状样品粘于导电胶上，进行喷金处理后利用场发射扫描电子显微镜在不同视野范围内进行颗粒微观结构观察。

1.3.4 FTIR光谱分析

参考Chen Shuai等的方法，将ZGP固体粉末状样品与溴化钾以1∶100的质量比进行混合后，在红外光照射下于研钵中研磨成均匀粉末。利用压片机将研磨后的粉末压成薄片后，在400～4 500 cm条件下进行扫描。

1.3.5 XRD分析

将ZGP固体粉末状样品平铺于玻璃板上，通过XRD仪考察加入GA对Zein晶体结构的影响。在25 ℃条件下进行测定，样品扫描范围5°～45°（扫描速率5°/min）。

1.3.6 热特性分析

1.3.6.1 ITC分析

参考Dai Taotao等的方法，进行Zein和GA之间相互作用的热力学参数测定与分析。将Zein-乙醇溶液通过反溶剂法，并通过旋蒸后得到Zein悬浮液。随后利用去离子水溶解GA，得到1 mg/mL GA溶液。在25 ℃条件下，将300 μL的Zein溶液放于反应池，利用注射器吸取50 μL的GA溶液，设定19 个滴定体积，在250 r/min转速下每次间隔120 s进行滴定。通过ITC仪器可以获得结合常数（）、焓变（Δ）、熵变（Δ）和吉布斯自由能变化（Δ）以及结合位点数（）。

1.3.6.2 DSC分析

准确称取5 mg的ZGP固体粉末状样品置于铝制坩埚中密封压紧，以空白铝盒作为空白对照。在温度范围30～180 ℃，升温速率为10 ℃/min条件下对样品进行DSC分析。

1.3.7 表面疏水性分析

利用ANS荧光探针法，将8 mmol/L的ANS溶解于PBS中（10 mmol/L，pH 7.0）。随后利用PBS稀释ZGP样品溶液至蛋白质量分数为0.015%～0.030%。将20 μL的ANS溶液加入4 mL样品中充分混合，随后在激发波长390 nm、发射波长400～700 nm处测定荧光强度。表面疏水性利用荧光强度和样品浓度的线性回归斜率表示。

1.3.8 由ZGP稳定的Pickering乳液的制备

将制备好的ZGP溶液作为水相，利用玉米油作为油相，二者以体积比1∶1混合后利用高速剪切机在10 000 r/min均质2 min，获得由ZGP稳定的Pickering乳液。

1.3.9 Pickering乳液的液滴粒径与电位分析

将Pickering乳液稀释20 倍后置于测试的比色皿中，利用ZS90粒径分析仪进行液滴粒径和Zeta电位测试（水的折射率为1.330，玉米油折射率1.470，温度25 ℃）。

1.3.10 Pickering乳液流变学分析

参考李梦帆的方法，对于Pickering乳液进行振荡扫描和频率扫描测定。将制备好的乳液均匀铺在加热板上，在0.5 Hz频率下，测定0～100 s剪切速率范围下的黏弹性模量。同时在1 Pa压力下，测定10～100 Hz范围内储能模量（′）与损耗模量（′′）的变化。

1.3.11 Pickering乳液贮藏期间氧化稳定性分析

为判断GA对Pickering乳液贮藏期油脂氧化的影响，在贮藏期间（50 ℃、20 d）对不同乳液状样品的初级氧化产物（脂质氢过氧化物）和次级氧化产物（丙二醛）产生量进行测定。

1.3.11.1 初级氧化产物

参考Meng Ran等方法，将0.3 mL的乳液样品分装在2 mL离心管中，加入1.5 mL的萃取液1（异辛烷-异丙醇（3∶1，/）），随后持续振荡1 min。混合物在4 500 r/min离心5 min后，收集200 μL的有机相并加入2.8 mL萃取液2（甲醇-正丁醇（2∶1，/））、15 μL硫氰酸铵（3.94 mol/L）、50 μL铁离子溶液（0.132 mol/L氯化钡和0.144 mol/L硫酸亚铁以1∶1体积比混合），在黑暗处反应20 min后，利用酶标仪在510 nm波长处测定吸光度。最终利用过氧化氢异丙苯标准曲线判断初级氧化产物含量。

1.3.11.2 次级氧化产物

采用丙二醛含量代表次级氧化产物含量。将1 mL乳液与2 mL的硫代巴比妥酸溶液混合（将15 g三氯乙酸、0.375 g硫代巴比妥酸、0.025 mol/L的盐酸溶解于100 mL蒸馏水中）。随后在沸水中煮沸20 min，恢复至室温后，7 000 r/min离心40 min，收集上清液后在532 nm波长处测定吸光度。丙二醛含量根据1,1,3,3-四乙氧基丙烷标准曲线进行测定。

1.4 数据处理

利用Origin 8.0和GraphPad Prism 7软件作图，通过SPSS和GraphPad Prism 7进行显著性分析，＜0.05，差异显著（≥3）。

2 结果与分析

2.1 ZGP理化性质分析

由图1a可知，ZGP的颗粒粒径集中在纳米级别，且呈现单一分散性。图1b中ZGP的平均粒径值呈现先上升后下降的状态，PDI值均低于0.4证明颗粒分散液的分散性质良好。Zeta电位由粒子与粒子之间的相互作用形成，是评价胶体分散体系稳定性能的重要指标。Zein和GA通过非共价结合发生了相互作用，根据图1c结果表明，ZGP颗粒的Zeta电位值均为正值，说明形成的颗粒分散液pH值低于Zein等电点。Zein与GA结合后，随着GA添加量增加，ZGP颗粒的Zeta电位值整体呈上升趋势，说明Zein表面电荷增加，颗粒之间的静电排斥力增强。在Zein与GA质量比为1∶0.5时Zeta电位值达到最高，达到46.6 mV。

图1 ZGP的粒径分布（a）、平均粒径与PDI（b）、Zeta电位（c）Fig.1 Particle size distribution (a),average particle size and polydisperse index (b),zeta potential (c) of zein/gallic acid composite nanoparticles

通过扫描电镜对ZGP的微观结构进行观察，结果如图2所示。其中，未加入GA的颗粒（图2a）表面并不光滑且形状不规则，而随着GA添加量的逐渐增加，颗粒逐渐趋于光滑平整的圆球状。说明了多酚类物质的加入可以对蛋白质的自组装现象产生影响，二者之间的相互作用（如氢键、静电相互作用等）可能发生改变。

图2 ZGP微观结构Fig.2 Microstructure of zein/gallic acid composite nanoparticles

2.2 ZGP相互作用与结构分析

FTIR光谱能够通过峰的位移和强度变化判断物质相互作用方式和程度。通常来讲，Zein的三大特征峰分别出现在酰胺A带（3 100～3 500 cm）、酰胺I（1 750～1 600 cm）和酰胺II带（1 550～1 510 cm），分别代表N—H键的拉伸与氢键变化、C＝O键伸缩振动、C—N弯曲和N—H弯曲。GA的特征峰出现在3 496 cm和3 278 cm，分别对应O—H键的振动拉伸。1 608～1 386 cm主要归因于芳香环C—C或C—H键的拉伸与弯曲振动。1 315～1 218 cm对应酚醇的O—H键；1 024～634 cm对应C—O键的拉伸和弯曲振动。如图3a所示，与GA特征峰相比，形成的复合纳米颗粒在3 496 cm处GA的特征尖峰消失；与Zein组和1∶0对照组相比，在1 097 cm处出现了属于GA的特征吸收峰。同时，随着GA添加量的增加，ZGP的酰胺A带出现了较为明显的红移现象，说明二者之间发生了结合，且主要作用力为氢键。

图3 ZGP的FTIR光谱（a）和XRD（b）分析Fig.3 FTIR (a) and XRD (b) analysis of zein/gallic acid composite nanoparticles

如图3b所示，单一Zein的XRD衍射角2分别出现在9.09°和19.20°，这与之前的研究结果一致。单一的GA XRD衍射峰呈现多尖峰的形态，表明其具有定向有序排列的高度结晶结构。由ZGP颗粒的XRD图可以看出，GA的特征结晶峰几乎完全消失。该结果表明，GA与Zein复合后，可能以无定型状态分布于复合物基质中。XRD和FTIR的结果在一定程度上具有一致性。

2.3 ZGP热力学分析

通过DSC实验可以对ZGP颗粒热稳定性的变化进行检测。如图4a所示，Zein的初始变性温度和变性峰值温度分别为43.31、81.31 ℃。随着GA添加量逐渐增加，当Zein与GA质量比为1∶0.5时，初始变性温度和变性峰值温度分别达到51.77、89.91 ℃。这说明GA的加入可能改变了Zein的结构，在一定程度上可以提升Zein的亲水力，从而提升其热变性温度，增强其热稳定性。

图4 ZGP的DSC（a）和ITC（b、c）图谱Fig.4 DSC (a) and ITC (b,c) analysis of zein/gallic acid composite nanoparticles

图4b、c展示了GA滴定Zein时体系发生的热焓值变化。当反应开始时，整个体系开始释放热量，随着GA的逐渐加入，整个体系释放的热量逐渐减少。当滴到第15～19滴时反应放热逐渐趋于平缓状态，说明二者反应达到饱和。根据Δ＜0，说明二者之间高度放热；根据Δ＜0，说明二者之间能够自发完成相互作用；根据Δ＜0，说明二者之间的相互作用主要为焓驱动而不是熵驱动。根据=8.97×10，说明二者之间的结合常数较高。该热力学结果也证明了Zein与GA二者之间的反应遵循热力学第二定律。

2.4 ZGP表面性质分析

前期研究表明，多酚可以改变Zein的结构，通过影响其表面疏水性调节Zein的自组装能力。通过图5可以观察到，随着多酚添加量的增多，表面疏水性呈显著降低的现象。说明多酚的添加可以引入亲水基团降低表面疏水性。Zou Yuan等的前期研究也证明，随着单宁酸这一酚类物质添加量增多，形成颗粒溶液的表面疏水性也呈现逐渐下降的趋势，证明了多酚的加入会对蛋白质的表面性质进行调控。

图5 ZGP表面疏水性分析Fig.5 Surface hydrophobicity analysis of zein/gallic acid composite nanoparticles

2.5 ZGP稳定的Pickering乳液理化性质分析

根据图6a可知，Zein与GA质量比1∶0对照组乳液液滴粒径为（317.1±0.85）nm，而添加GA的乳液液滴粒径均集中于200 nm以下，PDI值低也证明了由ZGP稳定的Pickering乳液的分散性较好。与1∶0对照组相比，经过高速剪切处理后，GA的加入会导致乳液液滴大小呈下降趋势。多酚类物质可能分布在界面层，液滴被覆盖，脂质液滴絮凝现象减弱。通过图6b也发现，电位值均为正值，证明此时乳液的pH值低于Zein等电点。

图6 ZGP稳定Pickering乳液的液滴粒径和PDI（a）、Zeta电位分析（b）Fig.6 Droplet size and polydisperse index (a) and zeta potential (b) of zein/gallic acid composite nanoparticles stabilize Pickering emulsions

Pickering乳液的流变学行为是表征Pickering乳液物理特性的必要手段。根据图7a中′和″可以判断，相同条件下，′均高于″，说明该乳液在外力作用下发生形变的可能性低，这可能与颗粒包裹的液滴形成的三维网络结构有关。从图7b结果也可以发现，随着剪切速率的逐渐上升，乳液黏度值逐渐下降，呈现出典型的剪切稀化现象，说明由ZGP颗粒稳定的Pickering乳液属于非牛顿流体。

图7 ZGP稳定Pickering乳液的流变学特性Fig.7 Rheological properties of zein/gallic acid composite nanoparticles stabilized Pickering emulsions

2.6 ZGP稳定的Pickering乳液氧化稳定性分析

油脂氧化会影响Pickering乳液的贮藏寿命。将由ZGP稳定的Pickering乳液放于50 ℃培养箱中加速氧化20 d，判断其在贮藏期间的初级氧化产物（氢过氧化物）和次级氧化产物（丙二醛）生成量变化（图8）。总体来说，GA的添加在一定程度上抑制了Pickering乳液的油脂氧化现象。在贮藏期内，所有组别的氢过氧化物值均有所上升，证明油脂在贮藏期间发生了氧化。随着GA添加量的逐渐增多，氢过氧化物值有所下降，从（21.69±0.2）mmol/L下降至（8.43±0.01）mmol/L（Zein与GA质量比1∶0.5）。其次，丙二醛生成量变化与氢过氧化物的生成量趋势基本一致，随着GA添加量增大，丙二醛生成量呈剂量依赖性下降，从（5.65±0.04）mmol/L下降至（2.60±0.02）mmol/L（Zein与GA质量比1∶0.5）。说明了与对照组Pickering乳液相比，ZGP稳定的Pickering乳液在一定程度上可以抑制贮藏期间产生的油脂氧化现象。由于GA的抗氧化活性中心主要集中在酚羟基，该基团的存在可以与油脂氧化产生的自由基结合，从而抑制油脂氧化现象的发生。此外，ZGP能够有效吸附在液滴周围形成稳定的抗氧化屏障，增加乳液的界面层厚度，提升乳液的空间位阻效应。同时可以阻止水相中促氧化物质进入油相，进而乳液体系的氧化稳定性有所提升。

图8 ZGP稳定Pickering乳液的初级氧化产物（a）和次级氧化产物（b）Fig.8 Generation of primary (a) and secondary (b) oxidant products in zein/gallic acid composite nanoparticles stabilized Pickering emulsions during accelerated storage

3 结论

成功制备ZGP，其粒径较小，GA的加入使得颗粒逐渐呈现光滑的圆球状。FTIR和XRD结果表明Zein与GA之间的作用力主要为氢键，二者结合后特征峰的改变证明了复合成功。热力学实验研究结果可知，Zein和GA之间为自发放热反应，而且随着GA添加量的增多，增强了复合纳米颗粒的热稳定性能。利用ZGP稳定Pickering乳液，结果发现乳液的液滴大小集中在纳米级别，呈剪切稀化现象，属于非牛顿流体。此外，由ZGP稳定的Pickering乳液在加速氧化期间展示出较好的氧化稳定性，具有抑制油脂氧化现象发生的能力。本研究结果可以为Zein的综合利用提供理论基础，并为脂溶性生物活性物质的包埋与递送提供新思路。