马 超，陈春秀，王 宇，刘 皓，于燕光，殷小亚，郑德斌，贾 磊，王群山，周 勇

(天津市水产研究所，天津 300221)

水产养殖快速发展在创造渔业经济的同时也产生了大量的含有有机物、含氮有害物质及抗生素等物质的养殖尾水，大量有害物质超标的水产养殖废水直接排放会对周围水生生态系统或近海生态系统造成显著影响。近年来，开发高效的海产养殖废水治理技术成为水产养殖的热点问题，而养殖废水中含氮元素的污染物是造成水体污染和富营养化的主要原因之一，因此如何去除养殖废水中的含氮有害物质对海水养殖废水排放及循环利用具有重要意义。为有效解决水产养殖尾水排放所引起的环境问题，目前各界学者通过研究开发出各种水产养殖废水处理的技术，包括物理处理、化学处理和生物处理等技术，其中生物处理技术具有环保、经济、高效等优点，在水产养殖尾水处理中应用广泛。

氨氮主要来源于水产养殖动物的残饵、排泄物、尸体等有机物，亚硝酸盐氮则是氮元素在养殖水体循环中的一种中间产物，含有一定毒性，高浓度氨氮及亚硝酸盐氮的养殖水体不仅严重危害水产动物的正常生长发育及导致病害频发，还会对周边生态环境造成恶劣的影响。而生物处理技术中主要是通过微生物调控来实现水产养殖尾水脱氮处理，目前生物脱氮技术已经成为该领域的研究热点，国内外学者从环境中分离筛选出多种高效脱氮细菌，包括芽孢杆菌()、假单胞菌()、不动杆菌()、红球菌()等细菌，因此筛选高效的脱氮细菌并应用到水产养殖尾水处理中，是调控养殖水体、保持循环养殖水体水质良好、实现绿色养殖的有效途径。该研究通过对半滑舌鳎养殖尾水处理系统生物填料中细菌进行分离、筛选、鉴定，并对其在养殖尾水中脱氮效果进行初步研究，对提高海水养殖水体处理系统的脱氮效率具有指导作用。

1 材料与方法

该试验菌株分离筛选自天津汉沽区半滑舌鳎工厂化养殖系统尾水处理中的生物填料。

取生物填料的水样悬液10 mL，用无菌水稀释制备成10的稀释液，取0.1 mL涂布在异养硝化固体培养基上，在培养箱中28 ℃恒温培养2～3 d，再挑取不同形态特点的菌落分离纯化3次以上直到获得单一的菌落为止。镜检验纯并采用甘油保存法-80 ℃保种。

将分离纯化的菌株送往上海微基生物科技有限公司进行16S rDNA序列测序，所得结果与NCBI数据库进行同源性比对，最后得出同源性最高的物种。

将分离纯化的菌株分别接种至装有100 mL异养硝化液体培养基的250 mL锥形瓶中富集培养，在培养箱中28 ℃、120 r/min培养24 h。再将富集后的菌悬液再次分别以1%的接种量接种至分别装有异养硝化培养基的250 mL锥形瓶中，于培养箱中28 ℃、120 r/min培养24 h后，移取摇匀的10 mL菌液，用离心机8 000 r/min离心后取上清液，检测其中氨氮浓度。测定方法参照海洋监测规范(GB 17378.7—2007)与《水和废水监测分析方法》进行。根据氨氮去除率，初筛出高效的硝化细菌。

菌株形态学鉴定。将初筛的高效硝化细菌接种于固体培养基平板，在培养箱中28 ℃条件下培养24 h后在显微镜下观察、记录菌落特征。在平板上选取单菌落挑于涂片上固定并进行革兰氏染色，在显微镜下观察、拍照和记录菌落形态特点，随后对筛选菌株进行扫描电镜观察并拍摄照片。

初筛菌株对养殖尾水的脱氮效果初步研究。从半滑舌鳎工厂化养殖系统尾水处理池取养殖尾水，抽滤后，分装到18个锥形瓶中，每瓶250 mL，向各水样瓶中分别以1%的接种量接入2株筛选得到的菌株(每组3个平行)。接种后，将水样置于28 ℃、120 r/min培养箱中培养24 h，24 h后取出水样测定水体中氨氮、硝态氮、亚硝态氮的含量，测定方法参照海洋监测规范(GB 17378.7—2007)与《水和废水监测分析方法》进行。

使用SPSS 20.0软件对所有试验数据进行单因素方差分析，试验数据均以平均值±标准差表示。采用Excel软件对试验数据进行统计分析并作图。

2 结果与分析

采集的生物滤池填料样品经分离纯化出7株形态大小不同的菌株，分别命名为WY1、WY3、WY4、WY5、WY6、WY8、WY10，将所测7株菌株的16S rDNA测序结果与GenBank数据库中核酸序列进行比对，结果显示，WY1、WY3、WY4、WY5、WY6、WY8、WY10分别与脱氮鲍曼氏菌()、麦氏交替单胞菌()、仙河盐单胞菌()、杜氏硫杆菌()、黄醇假交替单胞菌()、红色假交替单胞菌()和施氏假单胞菌()同源性最高，其初步鉴定结果见表1。

为进一步筛选出能够高效进行硝化作用的菌株，对7株菌株进行了氨氮去除能力检测，图1为7株菌株在氨氮初始浓度为101 mg/L的异养硝化培养基中接种24 h后的氨氮去除率，结果表明，分离纯化的7株菌株对氨氮均有一定的去除能力，其中WY10的氨氮去除率最高，为64.52%，其次为WY4的53.99%。因此，选择WY4和WY10为目标菌株进行下一步研究。

表1 不同菌株的16S rDNA同源性比较

图1 菌株在异养硝化培养基中培养24 h的氨氮去除率Fig.1 The NH4+-N removal rates of each strain in heterotrophic nitrification medium at 24 h

菌株形态及染色。WY4和WY10这2株菌株氨氮去除率效果较理想，对这2株细菌进行形态鉴定。将2株细菌在培养基平板上培养24 h后观察菌落形态特征，主要形态学特点见表2。革兰氏染色结果如图2所示，2株菌株均为革兰氏阴性菌。通过扫描电镜结果(图3)观察到WY4菌株为球状，WY10菌株为杆状。

表2 菌株的菌落形态特征

高效硝化细菌对养殖尾水脱氮效果。开展对养殖尾水脱氮效果初步研究，将筛选出的2株菌(WY4、WY10)接种到养殖尾水中(氨氮浓度为0.819 mg/L，亚硝态氮浓度为0.571 mg/L，硝态氮浓度为0.193 mg/L，总氮浓度为1.857 mg/L)培养24 h，结果如图4～5所示。从图4～5可以看出，菌株处理养殖尾水24 h后，水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮浓度均出现明显下降，WY4处理后水体中氨氮浓度为0.038 mg/L(去除率95.36%)，亚硝态氮浓度为0.002 mg/L(去除率99.65%)，硝态氮浓度为0.026 mg/L(去除率86.53%)，而菌株WY10处理养殖尾水24 h后，水体中的氨氮浓度为0.222 mg/L(去除率72.89%)，亚硝态氮浓度为0.032 mg/L(去除率94.40%)，硝态氮浓度为0.033 mg/L(去除率82.90%)，表明2株菌株均具有好氧反硝化作用，能够显著降低养殖水体中的硝态氮。

图2 菌株WY4(a)和WY10(b)的革兰氏染色Fig.2 Gram stain graph for strains WY4(a)and WY10(b)

图3 菌株WY4(a)和WY10(b)的扫描电镜Fig.3 The scanning electron micrograph of strains WY4(a)and WY10(b)

图4 接入菌株24 h后养殖尾水的氨氮、硝态氮、亚硝化氮浓度变化Fig.4 Concentration changes of ammonia nitrogen，nitrate nitrogen and nitrite nitrogen in aquaculture tail water 24 hours after inoculated strains

图5 不同菌株在养殖尾水中对氨氮、硝态氮、亚硝化氮的去除率Fig.5 Removal rates of ammonia nitrogen，nitrate nitrogen and nitrous nitrogen by different strains in aquaculture tail water

3 讨论

施氏假单胞菌()于1895年被Burri和Stutzer首次描述，近年来，越来越多的施氏假单胞菌菌株被从不同的环境中分离出来，如Su等从处理猪场废水处理系统中、Rezaee等从石油化工废水中都分离出施氏假单胞菌。此外有研究表明此细菌为异养硝化好氧反硝化细菌，此类细菌因以生长速度快、脱氮反应高效等优点被广大研究人员关注并应用，Ji等将施氏假单胞菌接种在生物滤池的硝酸盐废水中，结果表明废水中硝态氮去除率达到98.5%；张达娟等用从凡纳滨对虾养殖池塘中分离出来的施氏假单胞菌净化模拟养殖水体，结果表明，氨氮、亚硝态氮、硝态氮去除率分别达到91.73%、97.39%、91.22%。该研究从半滑舌鳎养殖尾水处理系统中分离筛选出的施氏假单胞菌菌株WY10通过鉴定为一株异养硝化-好氧反硝化革兰氏阴性菌，具有良好的氨氮去除效果，而且还有效降低了亚硝态氮和硝态氮的浓度，表现出良好的脱氮能力，施氏假单胞菌仅能以无机碳源为底物进行硝化-好氧反硝化脱氮，因此推断其代谢途径可能为完全硝化反硝化通路，与上述学者研究结果相似，但去除率有所差异，可能与菌株差异、培养温度、接种量等条件有关。

盐单胞菌()为中度嗜盐革兰氏阴性菌，大多数菌株适合在30 ℃和pH 7.2～7.5条件下生长，多数研究集中在盐碱环境中的石油烃降解，只有少数几株菌株的脱氮作用被报道，如孙雪梅等在网箱鱼类养殖区沉积环境中分离出的盐单胞菌X3和沈辉等在海洋滩涂沉积物中分离出的盐单胞菌MD5，在高盐环境下均具有较强的脱氮能力。该试验中分离的菌株WY4，通过16S rDNA序列同源性分析与仙河盐单胞菌()相似度最高，且生长特点符合盐单胞菌，有较强的脱氮能力，同时研究表明盐单胞菌菌株WY4具有异养硝化好氧反硝化细菌的特点，是一株具有潜力的海水养殖尾水净化菌株。通过试验发现，在处理养殖尾水时菌株WY4氨氮24 h去除率(95.36%)比初筛(53.99%)有所提高，王欢等研究表明细菌的异养硝化和反硝化作用是相互促进的，当硝化反硝化同时进行时，比单一作用的脱氮效率和菌体生长速度都有所提高。而该试验中，初筛时的溶液中氮主要以氨氮形式存在，而养殖尾水中不仅含有氨氮，还有一定浓度的亚硝态氮和硝态氮，24 h各形态氮的浓度都有所减少，由此推断菌株WY4在处理养殖尾水的同时发生了硝化和反硝化作用，从而提高了氨氮24 h去除率。

随着我国水产养殖的高速发展，工厂化养殖密度逐渐加大，残饵、粪便、养殖生物残骸等含氮有机物质不断积累，使得养殖尾水难以循环使用，加之环境资源保护意识不断提升及各种环保政策的落实，也使得养殖尾水排放成为困扰养殖企业的重要问题。传统的微生态制剂仅为光合细菌、乳酸菌和芽孢杆菌中的一种或多种，品种较为单一，且很少用于尾水处理，因此寻找具有绿色、环保同时能改善水质的菌株制成微生态制剂成为近年来水产养殖的热点。众多研究也表明从养殖尾水或池塘底泥中分离筛选的土著菌种脱氮效果更高。该研究从半滑舌鳎养殖尾水处理系统中分离筛选出的假单胞菌和盐单胞菌是常见的脱氮细菌，对养殖尾水也具有较强的脱氮能力，因此，它们具有广泛应用于工厂化养殖尾水处理的潜力，具有广泛的市场应用前景。但对这2株土著硝化细菌的脱氮机理和性质还有待进一步研究，尤其是作为微生态制剂的工艺和组合方式还有待探究。

4 结论

从半滑舌鳎养殖尾水处理系统中分离纯化出7株异养硝化细菌，对分离的菌株用16S rDNA序列分析进行了鉴定，7株菌株同源性最高的分别为脱氮鲍曼氏菌(WY1)、麦氏交替单胞菌(WY3)、仙河盐单胞菌(WY4)、杜氏硫杆菌(WY5)、黄醇假交替单胞菌(WY6)、红色假交替单胞菌(WY8)和施氏假单胞菌(WY10)。通过对7株菌株氨氮去除能力检测得到高效硝化细菌WY4和WY10，氨氮去除率分别为53.99%和64.52%，并对其进行了形态学观察和处理养殖尾水24 h脱氮效果的初步研究，结果表明WY10和WY4 这2株菌株均为革兰氏阴性菌，在处理养殖尾水24 h后，WY4菌株氨氮、亚硝态氮、硝态氮去除率分别为95.36%、99.65%、86.53%，WY10菌株氨氮、亚硝态氮、硝态氮去除率分别为72.89%、94.40%、82.90%。因此该研究筛选出的2株异养硝化细菌均为异养硝化-好氧反硝化细菌，具有调控海水养殖尾水的潜在应用价值。