李大命，刘 洋,2，刘燕山，张彤晴，殷稼雯，张 伟，穆新武，蒋琦辰

(1.江苏省淡水水产研究所，江苏省内陆水域渔业资源重点实验室，江苏南京 210017；2.南京师范大学海洋科学与工程学院，江苏南京 210046；3.江苏省骆马湖渔业管理委员会办公室，江苏宿迁 223800)

我国是鱼类资源较为丰富的国家之一，近几十年来，受气候变化、环境污染、过度捕捞及水利工程的影响，我国渔业资源量锐减，物种多样性和遗传多样性下降，严重威胁渔业资源可持续发展利用。快速、准确鉴定鱼类，是科学保护和管理鱼类资源的前提和基础。传统的鱼类鉴定是建立在鱼类形态特征基础之上，对分类人员的专业知识和鉴定能力要求较高。另外，由于鱼类的生物栖息环境多样，其形态结构易受到地理环境和不同发育阶段的影响，且鱼类“同种异形”和“异种同形”现象广泛存在，给鱼类种类鉴定造成困难。

DNA条形码(DNA barcoding)技术是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析而进行物种鉴定的技术，该技术具有不受样品性别、发育阶段、形态学变化限制的优点，且可以使物种鉴定过程实现标准化和信息化，近年来已成为生物分类学研究的热点。线粒体COI基因的进化速度比核DNA快，所积累的遗传变异足以区分近缘种，且该基因容易被通用引物扩增，因此COI基因被选定为动物界物种鉴定的标准基因。目前，COI基因作为DNA 条形码在鱼类的物种鉴定和多样性分析上也得到广泛应用，且已经建立了多个鱼类条形码数据库，为开展鱼类物种鉴定提供了便利。

建立水产种质资源保护区是水产种质资源就地保护的一种有效形式，对保护水产种质资源发挥了重要作用。经原农业部批准，骆马湖国家级水产种质资源保护区于2009年批准成立，保护区总面积3 160 hm，其中核心区面积1 000 hm，试验区面积2 160 hm。保护区的主要保护对象是鲤鱼和鲫鱼。近年来，有关骆马湖渔业资源调查的研究已有较多报道，但鲜见有关骆马湖鱼类DNA条形码的研究报道。该研究通过PCR扩增和测序，获得了骆马湖国家级水产种质资源保护区20种鱼类的COI条形码，并对COI基因序列特征、种内与种间遗传距离及分子系统进化关系进行分析，探索COI条形码在鱼类物种鉴定和分类中的适应性，以期为保护区鱼类资源保护和可持续开发利用提供基础资料。

1 材料与方法

该研究鱼类样本来源于2019年4月和9月对保护区开展的渔业资源监测所得渔获物。根据《江苏鱼类志》对鱼类样本进行种类鉴定，所分析的20种鱼类样本信息及其分类地位见表1。剪取鱼类样品背部的肌肉组织置于95%乙醇中保存，用于后续基因组DNA提取。

表1 鱼类样品信息及分类地位

采用TaKaRa公司的广谱型基因组DNA小量试剂盒提取鱼类样本的基因组DNA，并对DNA的完整性进行琼脂糖凝胶电泳检测，将DNA保存于-20 ℃冰箱备用。

采用鱼类DNA条形码通用引物进行PCR扩增，引物序列F1：TCAACCAACCACAAA GACATTGGCAC，R1：TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。PCR反应体系为50 μL，其中包括0.4 μL聚合酶(5 U/μL)、4 μL dNTP (2.5 mmol/L)、5 μL 10×PCR Buffer (含Mg)，上、下游引物各2 μL (10 mmol/L)，2 μL DNA模板，剩余部分超纯水补足。PCR反应程序:94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s,共30个循环；最后在72 ℃再延伸10 min。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物工程股份有限公司纯化并进行双向测序，测序引物与扩增引物相同。

利用BioEdit 7.0.5.3软件读取原始序列并进行人工校对，采用Clustal X1.83软件对序列进行多重比对分析，获得长度一致的同源序列，并在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ blast.cgi) 和BOLD (http://www.boldsystems.org)分别进行相似性检索。采用DnaSP 6.12.03软件定义序列的单倍型。利用MEGA 7.0软件统计序列的碱基组成、变异位点、简约信息位点、单一信息位点等，并基于Kimura′s 2-parameter双参数替代模型计算不同分类界元间的遗传距离。采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建单倍型分子系统进化树，并进行1 000次自展分支检验。

2 结果与分析

通过PCR扩增、测序和分析，共获得20种鱼类的201条COI基因条形码序列，COI条形码长度为630 bp。COI序列碱基的平均含量分别为A 24.4%、C 28.3%、T 28.5% 和G 18.8%，碱基A+T的含量(52.9%)高于G+C的含量(47.1%)，表现出明显碱基组成偏倚性，符合多数鱼类线粒体COI序列的碱基组成特征。另外，各密码子的碱基含量差异明显，第1密码子位点G+C的含量(58.8%)明显高于第2和第3密码子位点G+C的含量(分别为44.2%和38.5%)。所有COI序列没有插入或缺失位点，保守位点有379个，变异位点有251个，简约信息位点有239个，单一信息位点有12个。

表2 不同分类界元间的遗传距离

基于20种鱼类的COI基因序列，构建COI序列单倍型NJ系统进化树(图1)。从图1可以看出，同一种类的所有个体都聚为一支，且置信度很高，20种鱼类全都形成了单系类群，与基于形态学的物种鉴别一致。且同一属内、科内、目内的不同种类也能很好的聚类，形成了独立的进化分支，表明COI条形码对于不同分类界元的鱼类具有广适性。

图1 基于COI序列构建的NJ系统进化树Fig.1 NJ phylogenetic tree constructed based on COI sequence

3 讨论与结论

近20年来，DNA条形码技术发展迅速并被广泛应用，它突破了分类学只能依靠形态特征来完成的传统，为分类学开辟了一条新的途径，将完成一些传统形态学鉴定手段无法完成的工作。随着鱼类DNA条形码序列的积累和全球鱼类条形码数据库的建立，DNA条形码在鱼类物种鉴定的准确性进一步提高，应用范围也越来越广泛。

截至目前，线粒体的COI基因是动物DNA条形码研究中使用最为广泛的标准基因，它具有DNA条形码理想序列的3个基本判断标准：①序列变异水平适宜；②变异区域两端的序列高度保守；③序列长度适宜且易于获得。一般来说，基于DNA 条形码进行物种鉴定取决于2个方面:①同一物种的种内遗传距离要小，不同物种的种间距离要大，且种间距离要明显大于种内距离；②在系统进化树上，同一物种的不同个体能聚为同一分支。有研究指出，利用线粒体COI 基因作为条形码对物种鉴别时认为种内的遗传距离不得大于0.02， 且种间距离至少是种内距离的10倍以上才可有效判别物种。该研究首次获得了骆马湖国家级水产种质资源保护区20种鱼类的COI条形码序列，并计算了各个分类单元的遗传距离。结果显示，20种鱼类的种内遗传距离均小于0.02，种内遗传距离平均值为0.002 9；种间遗传距离为0.008 0～0.308 8，平均值为0.202 5，种间遗传距离为种内遗传距离的70倍。从系统进化树来看，20种类鱼类均形成单系群，说明基于COI条形码对鱼类进行物种鉴别是可行和有效的。该研究结果进一步证明了COI条形码在鱼类鉴定中的适用性，也补充和丰富了鱼类条形码数据。另外，科内属间的遗传距离平均为0.150 3，目内科间的遗传距离平均值为0.206 1，目间的遗传距离平均为0.236 4，表明遗传距离随着分类阶元的提高而增大，且不同的目科属内的种类也都独立聚为一支，说明COI条形码对于高阶分类单元的系统进化分析也有重要的参考价值。

线粒体的COI基因作为DNA条形码在不同生物类群中应用的有效性得到了越来越多的验证，COI通用引物的广泛适用性也已在鱼类研究中得到良好证明。然而，COI条形码在近缘鱼类物种鉴定过程中仍存在一定局限性。比如，该研究中大鳍鱊和兴凯鱊的种间遗传距离较小，仅为0.008 0。还有研究表明，光泽黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼和长须黄颡鱼以及长须黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼的种间遗传距离均小于种内遗传距离的10倍。因此，对于亲缘关系较近的鱼类，可以选择其他DNA条形码(线粒体Cytb基因或控制区序列)和COI条形码联合进行物种鉴定和进化分析，以获得更加准确的结果。