刘海成,程金平,冯培媛,刘晓刚,马嘉欣,田普江,田 蕾,李培富

(宁夏大学农学院，银川 750021)

【研究意义】铁是人体中参与氧的运输和存储、参与细胞色素和某些金属酶的合成、维持正常造血功能等新陈代谢中的重要元素，其中65%的铁以血红蛋白的形式存在红细胞中，10%的铁以肌红蛋白和酶的形式存在肌肉中，其余的铁存在于肝、脾等组织器官中[1]。人体缺铁会导致贫血、呼吸急促、心跳加速以及嗜睡等微量元素缺失综合征[2]。水稻是世界上食用人口最多的主食，也是能量和营养的来源之一[3]。铁元素在水稻细胞呼吸、光合作用和金属蛋白的催化反应过程中起着重要作用[4-5]。【前人研究进展】近几年来，水稻籽粒矿质元素含量研究成为了国内外水稻研究的热点之一。现已表明，水稻体内铁含量主要受遗传控制[6]。已有研究表明，水稻不同部位铁含量不同，并且水稻铁含量受基因的加性效应和非加性效应影响，主要以加性效应为主[7]。王辉[8]以“京香1号/宁农黑粳”为亲本杂交再自交获得的F2为材料，将控制水稻铁含量的QTL定位在3、4、5、7和9号染色体上，并且位于4号染色体的3个QTL在相邻的区段内。黄莹莹等[9]也得出6号染色体上的QTL具有此特点。【本研究切入点】铁含量是受多基因控制的数量性状。挖掘控制铁含量的QTL是富铁水稻选育的基础，对改善水稻品质具有重要意义。【拟解决的关键问题】选用铁含量差异较大的两个材料作为亲本进行杂交再自交获得124个RIL家系，从后代籽粒所含铁含量入手，研究其遗传规律，采用SSR标记构建遗传连锁图谱，进行铁含量的QTL定位。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验以“宁农黑粳”(铁含量46.23 mg/kg)为母本，“高粱稻-1”(铁含量14.32 mg/kg)做父本，构建以“宁农黑粳/高粱稻-1”杂交再自交培育出的F6重组自交系124 个株系为材料。

1.2 方法

1.2.1 田间试验 于2019年4月14日育秧。5月15日种植在宁夏大学繁殖基地。每个家系采用单株插秧，每行10株，行长1.2 m，行距0.3 m，株距0.1 m，其田间管理同大田管理。在分蘖期进行田间取样，每个家系取2片新鲜叶片进行DNA的提取，等植株到完熟期时，进行籽粒的收获，供表型的测定。

1.2.2 水稻糙米中铁含量的标准曲线绘制与测定 将1 mL铁标准溶液(1 mg/mL)准确吸入于100 mL容量瓶中，然后用1%的稀硝酸定容，配制成10 μg/mL母液备用。准确吸取0、1、2、4、6、8 mL的母液到6个50 mL棕色容量瓶中，再以1%的稀硝酸定容，配制成 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μg/mL浓度梯度的标准溶液，摇匀待测。

水稻糙米中铁含量的测定参照王辉[8]的方法，按照 Z-2000 型原子吸收分光光度计的操作要求，打开仪器，设置测定条件，打开真空泵和乙炔气并调整气压，点火调零。以 1%的稀硝酸为空白对照，依次按上述溶液进样，测定样品的吸光值。利用 Microsoft Excel 2010以铁浓度(μg/mL)为横坐标，吸光值(A)为纵坐标绘制标准曲线(图1)。

1.2.3 数据处理 将所测数据输入到Microsoft Excel 2010 中，计算铁含量，并计算3个重复的平均值，利用 SPSS 23.0 对数据进行铁含量的统计分析。具体计算方法如下：

Fe=ppm×v/w×10-4

式中，ppm是在标准曲线上查得样品液浓度；v是样品制备成溶液的体积；w是样品重量(g)；10-4是将ppm换算成百分含量的应乘因数。

1.2.4 DNA的提取、PCR扩增及染色 利用简化的CTAB法进行叶片DNA的提取。PCR反应体系总计20 μL，DNA 2 μL，ddH2O 13.7 μL，10×DNATaqbuffer 2 μL，dNTP 0.4 μL， SSR 引物1.5 μL，Taq酶0.4 μL。具体PCR程序与染色参照Sun等[10]的方法。

1.2.5 遗传连锁图谱构建及QTL定位 根据3.6%的琼脂糖凝胶电泳检测结果，读取F6群体带型，与“宁农黑粳”一样的读2，与“高粱稻-1”一样的读0，杂合的读1，缺失读-1。利用QTL iciMapping 3.0软件进行遗传连锁图谱的构建及QTL定位，QTL命名按照McCouch等[11]的方法。

2 结果与分析

2.1 亲本及F6群体的铁含量表现

通过Z-2000型原子吸收分光光度计对水稻糙米铁含量的测定，结果(表1)表明亲本的铁含量分别为46.23和14.32 mg/kg，双亲铁含量差异较大，F6群体铁含量平均为18.53 mg/kg。对F6群体铁含量进行正态分布检测并对最大值、最小值和标准差等基本统计量进行分析。结果(图2)表明F6代群体中铁含量呈正态的单峰连续分布，介于亲本之间且偏向于“高粱稻-1”，说明水稻籽粒铁含量是受多基因控制的数量性状。

表1 亲本及F6群体的铁含量

2.2 引物多态性的筛选与遗传连锁图谱的构建

通过上网查询已经公布的水稻分子遗传图谱和实验室现存的1558 对SSR标记在“宁农黑粳”和“高粱稻-1”之间筛选多态性，共获得多态性引物130对，多态率为8.34%，引物多态性数目较少，多态率偏低，是因为此试验所运用的材料是双亲都为粳稻的杂交组合后代群体，遗传背景相似所导致的。由表2可知，其中第8号染色体扩增的引物数最多为14对，多态率8.19%；第4号染色体扩增引物最少为8对，多态率仅有5.8%，其他染色体扩增引物数相对均匀(9～12对)，其中第10号染色体多态率最高为10.28%。本试验选择双亲间有多态，扩增效果好，条带清晰的SSR引物，共计130对，用于“宁农黑粳/高粱稻-1” F6群体遗传连锁图谱的构建。

2.3 SSR引物在F6群体中的分离

选取多态性较好的130个SSR标记进行3.6%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳完成后在凝胶成像仪上进行条带统计(图3)。与母本“宁农黑粳”带型相同的记作A，与父本“高粱稻-1”带型相同的记作B，双亲杂合带型记作H,模糊不清或者缺失的记作-。

2.4 遗传连锁图谱构建

利用 QTL iciMapping 3.0软件对130对SSR引物划分连锁群，根据每个SSR引物之间交换率，计算各标记间的连锁遗传距离，绘制连锁遗传图谱。构建了一张包含130个SSR标记的遗传连锁图谱(图4)，覆盖了水稻全基因组1209.77 cM，平均为9.31 cM。除第4号染色体(8对SSR)和第8号染色体(14对SSR)外，其他染色体的标记分布均匀(9～12对SSR)。在整个遗传连锁图谱中，最小和最大

表2 检测的亲本间多态性标记

遗传距离的表现在第3号染色体上，标记RM8203和RM8267之间是最小的距离为0.44 cM，标记RM8277与RM7117之间是最大的距离达42.94 cM，基本满足 QTL 定位的要求。

2.5 水稻糙米铁含量的QTL定位分析

利用所绘制出的遗传连锁图谱和 QTL iciMapping 3.0 软件，采用复合区间作图法，LOD值为2.5对控制水稻籽粒铁含量的QTL进行定位。有3个QTL位于第1、8和12号染色体上(表3)，分别命名为qFe1、qFe8和qFe12，其贡献率在14.31%～18.44%，其中第1和8号的QTL加性效应为负值，第12号染色体的QTL加性效应为正，而贡献率最高qFe8增效基因来自铁含量高的亲本“宁农黑粳”。运用 ICIM-ADD 的复合区间作图法对控制水稻籽粒锌含量的主效 QTL 进行区间作图(图5)，对富铁水稻育种有一定的指导意义。

表3 “宁农黑粳/高粱稻-1” F6群体铁含量QTL定位结果

3 讨 论

3.1 水稻籽粒铁含量的遗传分析

铁作为人体生长发育必不可少的矿质元素之一，其在水稻籽粒中的含量研究备受青睐。孙明茂[12]利用“龙锦1号/香软米1578”为组合繁育的F3代196个株系为材料，用原子吸收光谱法测定其含量和频率分布，研究表明后代铁含量平均值为35.1 mg/kg且介于两亲本之间，表现出连续的正态分布。崔文刚[13]对“香黑糯195/中花紫香糯”作亲本杂交的F2代188个群体为试验材料，用原子吸收光谱法测定了铁含量，结果表明水稻籽粒铁元素的含量出现偏低亲本的偏态分布。钟林[14]以“川香29B/Lemont”为亲本衍生的184个RIL群体为研究对象，利用全普直读等离子光谱仪测定了铁含量并发现，铁含量呈连续变异。黄莹莹等[9]分析了“红香1号/松98-131”F3代铁含量，研究表明籽粒含量介于两者之间呈正态分布且表现出明显的双向超亲分离现象。本研究以“高粱稻-1/宁农黑粳”的124个F6代为研究对象，采用原子吸收光谱法测定铁含量，其“高粱稻-1”为14.32 mg/kg，“宁农黑粳”为46.23 mg/kg，后代平均为18.87 mg/kg。对124 个株系做正态分布检验，表明铁含量偏向低值亲本且呈正态分布。此结果与前面所述学者研究结果基本相符。因此可推断铁含量受多基因控制的数量性状。

水稻籽粒铁含量与稻米颜色、水稻品种等存在一定的联系。Koh等[15]研究表明，黑米色素沉积性状随着水稻中铁含量增加而增加。吕文英[16]研究发现，水稻籽粒中铁含量与粒色有一定的相关性，黑米铁含量最高，红米次之。Gregorio等[17]研究发现，水稻香味与铁含量有一定的相关性。而Yang等[18]研究发现，精米中铁含量与食味值无显著相关性。本研究选用的宁农黑粳为黑米，其铁含量较高，这一结果与前人结果[8]相似。因此利用稻米中铁含量与米皮中色素的结合关系，可以通过米皮颜色的判断来筛选富铁种质。这为在研究实践中对富铁水稻的初步筛选提供了依据，从而可以提高筛选效率。

3.2 水稻籽粒铁含量的QTL定位分析

现有相关文献报道，合理的标记数有利于遗传连锁图谱的构建，当标记之间的遗传距离为5和21 cM时被估计的QTL的位置和效应结果无差异，遗传距离太大或者太小都不利于检测QTL[19-20]。研究[21]表明，遗传连锁图谱的平均遗传距离不超过20 cM为宜。本研究用“高粱稻-1/宁农黑粳”的F6群体构建了含有130 对SSR标记的遗传连锁图谱，覆盖了水稻全基因组1209.77 cM，平均为9.31 cM，与上述学者所述基本吻合，适合用于QTL定位。

铁作为水稻营养品质的一个重要指标，对生物体新陈代谢有不可替代的作用。因此对水稻籽粒铁含量的QTL定位有重要意义。Dixit等[22]使用RP-Bio226/Sampada回交的BC2F5群体及108个SSR绘制出了2317.5 cM，平均标记21.5 cM的遗传连锁图谱，研究发现，控制铁元素的QTL有2个，分别位于第1和第6号染色体上，LOD值在2.6～10，贡献率在5.1%～17.1%。Norton等[23]使用Bala/Azucena杂交的RIL群体，利用164个SSR标记构建了一个覆盖水稻12条染色体1833 cM的遗传连锁图谱，对田间生长的水稻群体的叶片和籽粒进行了多元素分析，测定了控制铁、锌等17个矿质元素的QTL,结果表明，在叶片中检测到3个与铁相关的QTL，分别位于1、3和6号染色体上，贡献率分布范围为10.4%～12.4%。Anuradha等[6]以Madhukar/Swarna衍生的RILs群体对控制水稻铁含量的QTL进行检测，研究发现有7个控制铁含量的QTL，位于第1、5、7和12号染色体，其中12号染色体RM17-RM260标记的QTL贡献率最高为71%，LOD值33.8。本实验中，共检测到3个控制铁的QTL，位于第1、8和12号染色体上，LOD值为2.5，贡献率在14.31%～18.44%。在检测到的3个QTL中，第1号染色体上RM5～RM488区间的qFe1与Anuradha等[6]检测RM243～RM488和RM488～RM490的位置相近；第8号染色体qFe8的区间RM432～RM331与孙明茂[12]检测到的区间RM547～RM72相邻；位于12号染色体上的QTL在Anuradha等[6]检测的RM17～RM7120区间内。

4 结 论

本研究利用“宁农黑粳”和“高粱稻-1”为亲本杂交再自交获得124个单株F6群体为材料，结合130个SSR(Simple sequence repeat)分子标记发现3个与铁含量相关的QTL位点，分别位于1、8、12号染色体。本研究未能在其他染色体上定位到相关的QTL，由于QTL受遗传因素的影响，不同材料、不同条件下种植检测到的QTL各不相同。因此，挖掘控制铁的QTL对今后富铁水稻育种提供了理论依据，为揭示水稻籽粒铁含量的分子机制奠定基础。