刘瑞, 呼秀智, 杨昭颖, 陈冬东, 黎烨昕, 呼念念, 彭涛

（1.中国检验检疫科学研究院, 北京 100176；2.河北工程大学 生命科学学院, 河北 邯郸 056107）

0 引言

黄曲霉毒素是生活中接触最广泛且毒性、致癌性最强的真菌毒素[1-3], 是由黄曲霉、寄生曲霉真菌菌株在生长繁殖过程中产生的易引起人和动物生理病变的活性物质[4]。目前已经分离鉴定出超过20种黄曲霉毒素及其衍生物的存在, 最常见的为黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1, AFB1）、黄曲霉毒素B2（aflatoxin B2, AFB2）、黄曲霉毒素G1（aflatoxinG1, AFG1）、黄曲霉毒素G2（aflatoxin G2, AFG2）、黄曲霉毒素M1（aflatoxin M1, AFM1）、黄曲霉毒素M2（aflatoxin M2, AFM2）。一直对全球粮食业和畜牧业食品安全都造成着严重影响。Han等[5]在2017年对我国玉米小麦等主要谷物饲料中的黄曲霉毒素进行检测, 结果均有黄曲霉毒素检出, 阳性检测率高达100%。动物若食用被污染的饲料则其乳汁中通常能检测到B族及M族黄曲霉毒素[6], 人体长期摄入被污染乳品可产生中毒、致癌、致突变和致畸等作用, 科学家们虽长期致力于乳品中黄曲霉毒素预防及降解技术的研究, 但迄今为止仍缺乏经济适用、大规模有效的解决污染的办法。故我国于2017年发布的食品中真菌毒素限量要求[7]中规定了乳品中AFM1的限量要求为0.5μg/kg, 欧盟规定婴幼儿食品中AFM1的安全限量则为0.025μg/kg, 而在埃及、罗马尼亚、尼日利亚等地区更是不得检出。据《（2020）中国奶业质量报告》显示2019年我国奶类产量达到3297.6万t, 居世界第4位, 但还远不能实现国人每天一杯奶的消耗需求。面对日益增长的乳品产量及消耗量, 研究建立可以准确高效地测定乳品中黄曲霉毒素的现代检测技术来保障乳品安全尤为重要。

近年来, 检测不同食品基质中各种真菌毒素的方法随着检测仪器的发展而迅速发展起来, 由于摄入过多被黄曲霉毒素污染的乳品会对身体造成不可逆转的伤害。因此, 建立高效快速、准确性好的黄曲霉毒素检测方法尤为必要。本文综述了乳品中黄曲霉毒素提取方法、净化方法及检测技术的研究进展, 以期为日后开展黄曲霉毒素的检测技术研究提供参考。

1 材料与方法

前处理技术是检测乳品中黄曲霉毒素残留的关键操作步骤, 乳品在检测之前都需要技术人员通过正确的方式进行前处理操作, 有效去除样品中的杂质, 确保得到精确可靠地检测结果。

1.1 提取技术

提取是样品基质前处理的第一步, 即采用物理或化学方法把待测物从样品基质中分离出来转移到易于检测的有机溶剂中。

应根据样品基质与待测物的具体性质, 按照“相似相容”原理选择合适的提取溶剂溶解待测物。通常选用甲醇或乙腈作为黄曲霉毒素的提取剂。张国梁等[8]采用乙腈提取干酪制品中黄曲霉毒素M1的残留, 用高效液相色谱法最低检出限为0.037μg/kg, 成功用于干酪中黄曲霉毒素M1含量的测定。为增加提取的选择性, 也经常采用混合溶剂进行黄曲霉毒素的提取。在提取溶剂中加入一定比例的水来提高有机溶剂的渗透率, 从而提高待测物的回收率。毕瑞锋等[9]用甲醇-水(体积比为8∶2)提取分析物同时沉淀蛋白, 过弗罗里硅土柱净化, 用5 mL丙酮-水-甲酸混合溶液(体积比为96∶3.5∶0.5)洗脱, 完全适合液体奶中黄曲霉毒素M1的日常监控。童圆等[10]建立液态奶制品中的黄曲霉毒素M1和B1的方法采用乙腈-正己烷提取样品基质, 结合固相萃取一高效液相色谱荧光法测定, 黄曲霉毒素M1和B1在0.1～50μg/kg线性关系良好,相关系数的平方大于0.9996,该方法稳定性好, 检测成本低。提取环境的pH也可影响前处理提取效率, 黄曲霉毒素在中性和弱酸性溶液中较稳定, 因此多在提取溶剂中加入酸[11]等促进毒素的提取。提取方式的选择不同也会在一定程度上影响待测物提取效率。常见的提取方式有振荡提取、超临界流体萃取、超声辅助提取、微波辅助提取、加压液体提取、脉冲电场辅助提取、酶辅助提取等。

1.2 净化技术

净化是指在样品检测前, 为了提高检测结果的灵敏度, 除去待测基质样品中的蛋白质、脂肪、色素等杂质干扰物的过程, 是前处理中必不可少的一步。

1.2.1 液-液分配（Liquid-liquid partition,LLP）

液液分配是应用相似相溶原理, 利用不同物质在溶剂中溶解度的不同来达到从样品基质中分离杂质和提取待测物的目的。该技术操作简单、设备简单、价格低廉。常用的溶剂有甲醇、乙腈、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷等有机溶剂。液液分配技术在真菌毒素样品前处理中应用较为成熟。传统液液分配技术对有毒有害有机溶剂使用量较大。而仪器辅助分配法和溶剂辅助分配法这种新型液液分配技术能有效减少有毒溶剂的使用, 缩短萃取时间。刘佳盟等[12]采用溶质辅助液液分配法在乙腈提取液中加入辅助盐氯化钠提取纯牛奶及乳粉中的黄曲霉M1, 该方法的检测限可达0.06μg/kg, 加标回收率在91.2%～105.5%, 相对标准偏差在1.90%～2.84%之间, 该方法成本低廉、灵敏可靠, 可替代现有黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的液液分配方法。

1.2.2 固相萃取(Solid phase extraction,SPE)

固相萃取技术一般包括萃取柱预处理、上样、淋洗及洗脱4个步骤, 固相萃取技术简单方便、回收率高、应用范围广、易于实现自动, 已成为国内农兽药及真菌毒素残留检测样品最常用的前处理技术之一, 很多现行检测标准都会采用SPE柱净化技术。但是其浓缩过程消耗的时间较长, 在进行大规模检测时会增加前处理时间[13]。传统SPE使用的吸附剂主要是C8、C18和苯基等有机基团键合二氧化硅等材料。董彬等[14]采用乙腈-水溶液(86∶14,体积比)提取样品,Romer 226多功能柱净化样品,建立了简单、快速测定牛奶中黄曲霉毒素M1的液相色谱-质谱-质谱法, 外标法定量, 结果显示两种浓度样品加标回收率为71.5%和83.5%,相对标准偏差为2.7%和8.4%, 适用于牛奶中的黄曲霉毒素M1准确定量。张国梁[15]采用乙腈作提取剂, 用亲水亲脂OASISHLB柱（以二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮按比例聚合成的大孔共聚物为填料）代替免疫亲和柱净化样品, 建立了用HPLC法检测干酪中黄曲霉毒素M1的方法, 对干酪中AFM1的平均回收率在87.1%～92.2%, 最低检出限为0.037μg/kg。对比国标中第二法, 该方法节约成本, 检测时间缩短, 可以为干酪样品的检测提供参考。孙晓冬等[16]建立使用固相萃取柱净化液态乳中5种黄曲霉毒素多残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品经含0.1%甲酸-乙腈沉淀蛋白和提取,Oasis PRi ME HLB柱净化后,以0.1%甲酸溶液与乙腈为流动相,梯度洗脱。测得定量限(RSN≥10)为0.55μg/kg, 加标平均回收率为67.7%～112.7%, 结果表明该方法净化效果较好, 基质干扰较少, 可用于液态乳中真菌毒素的检测分析。Mohammad等[17]建立了一种基于磁性纳米颗粒和适配体的高特异性吸附剂来提取牛奶中的AFM1, 是一种成本低廉的能代替免疫亲和净化的方法, 见表1。

表1 固相萃取净化黄曲霉毒素

1.2.3基质分散固相萃取（Matrix solid-phase dispersion,MSPD）

该技术使样品前处理过程变得简单快速, 减少了样品待测物的损失和溶剂的使用, 具有回收率高重复性好等优点, 常被用于果蔬基质中的农药残留检测。在乳品中黄曲霉毒素检测方面常与QuEChERS技术结合萃取, QuEChERS技术最早于2003年由化学家Lehotay和Anastassiadas提出[18]。经过不断的技术优化,已广泛应用于农药残留的分析检测中,QuEChERS技术分为提取、盐析和净化3个重要步骤。于建玉等[19]选择50 mg NH2和50 mg PSA作为分散固相萃取材料对牛奶提取液进行净化处理, 基于改进的QuECh-ERS技术建立了检测牛奶中黄曲霉毒素M1方法, 方法回收率为93.4%～102.2%,检出限为0.02μg/kg, 比国标中免疫亲和柱法更为简便, 缩短了分析时间, 更适用于大批量样品的检测分析。曲斌等[20]建立了一种以QuEChERS作为前处理方法的生鲜牛乳中黄曲霉毒素M1的快速测定方法。生鲜牛乳以Sampli Q萃取剂(内含4 g硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸三钠二水结晶盐、0.5 g柠檬酸氢二钠半水结晶盐)提取,在Sampli Q净化管(内含900 mg硫酸镁、150 mg C18)中净化并浓缩后,以超高效液相色谱串联质谱法测定。黄曲霉毒素M1在0.1～20.0μg/kg范围内呈良好的线性关系,回收率大于80%,检测限为0.05μg/kg。特别适用于在复杂基质中对目标化合物的快速、批量筛选,同时提供准确的定性定量分析结果, 见表2。

表2 牛奶基质分散固相萃取净化黄曲霉毒素

1.2.4 免疫亲和色谱（Immunoaffinity chromatography,IAC）

免疫亲和色谱法是一种以抗体与惰性基质固相载体偶联为基础的新型固相萃取技术, 该方法特异性强、选择性好、高效灵敏。随着技术的发展, 部分真菌毒素的免疫亲和柱已实现商品化, 但是价格昂贵。徐燕等[21]建立了牛乳、酸牛乳及乳粉中AFM1残留的高效液相色谱分析方法。以亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白质和脂肪, 将样品过免疫亲和柱固相萃取净化, 方法回收率为71.0%～80.5%, 检出限0.003μg/kg。该法提取样品简单方便, 检测速度快, 所用试剂少, 适合大批量样品处理。黄隽灏等[22]使用免疫亲和柱净化高效液相色谱法测定生鲜乳样品, 阳性样品加标回收率在95.00%～105.00%之间, RSD＜5.00%, 加标回收试验的准确性和重现性均达到测定生鲜乳中AFM1含量的要求。刘云花等[23]建立了同时检测生鲜牦牛乳中的AFM1及AFM2的分析方法。样品经低温离心, 过免疫亲和柱净化, 甲醇洗脱, 结果显示线性关系良好, 回收率为82.1%～95.5%, 检出限为0.0015～0.1μg/kg。结果表明生鲜牦牛乳中黄曲霉毒素M1和M2安全可控。为其它基质中黄曲霉毒素的同时检测提供技术支持, 见表3。

表3 免疫亲和柱净化黄曲霉毒素

1.2.5 凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography,GPC）

凝胶渗透色谱技术是利用溶质分子体积大小的不同使其在凝胶色谱柱上的保留时间有所差异进行基质待测物分离的, 其优点在于分析速度快, 能重复利用柱子, 重现性好, 能够快速分离出样品基质中的大分子油脂和色素等杂质。段兵等[24]针对乳品中的安全问题, 结合GPC技术样品过Bio-Beads S-X3净化柱, 用乙酸乙酯-环己烷(1∶1,体积比)作为流动相, 建立了检测奶及奶粉样品中AFM1的超高效液相色谱串联质谱的分析方法, 加标回收率为72.4%～92.2%。结果表明GPC技术能够有效地去除奶及奶粉中蛋白质和脂肪等大分子干扰物质。该方法稳定性高, 操作简单安全, 成本低, 快速准确, 适用于乳品中AFM1的快速测定。

2 测定方法

样品经过前处理之后就需要选择合适的测定方法进行检测。目前乳品中黄曲霉毒素的检测方法主要有以下几种：薄层色谱分析法（TLC）[25]、高效液相色谱法（HPLC）[26]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLCMS）[27-28]、酶联免疫测定法（ELISA）[29-30]以及胶体金法（GICA）[31]。近年来, 色谱质谱联用技术已经发展成了污染残留检测的主流技术。

2.1 色谱分析技术

2.1.1 薄层色谱分析法(TLC)

该方法适合对真菌毒素进行定性研究。主要是将某种特定物质作为固定相涂布于玻璃或塑料板上, 再用某种溶剂作为流动相在紫外光照射下对经过前处理的样品基质进行定性定量。20世纪60年代被广泛应用于乳品中AFM1的大规模筛选中。但其步骤多, 耗费大量试剂, 干扰因素多, 测定一个样品需要2～3 d时间, 且该方法的主要缺点是灵敏度不高且定量不准, 缺乏特异性和安全性, 无法达到高通量分析的检测要求, 已逐步被其他更高效便捷的检测方法所取代, 近些年很少有文献报道。

2.1.2 高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱技术是20世纪60年代后期发展起来的一种新一代色谱测定技术。GB5009.24-2016[32]中给出的高效液相色谱法虽然对技术和操作要求比较高, 使用化学药剂和处理方式较为繁琐, 但是在基层实验室中应用最广泛。朱丹倩等[33]参考国标用甲醇-水溶液作为试样提取剂, 用甲醇∶水=54∶46（体积比）作为流动相, 加吡啶鎓三溴化物为衍生剂, 来提高检测灵敏度, 并且使试样可同时检测黄曲霉毒素B族。选择用甲醇洗脱待测物, 氮吹至1 mL以下直接加水稀释至1 mL来减少溶剂效应的产生。加标试验回收率在83.6%～94.2%, 方法检出限为0.02μg/kg, 该方法简便快捷, 准确性好, 灵敏度高。张胜利[34]在现行国标基础上建立了UPLC-FLD法测定奶制品中黄曲霉毒素M1的检测方法。以甲醇∶水∶乙腈=15∶75∶15（体积比）作为流动相, 采用等度洗脱方式, 在进样量为3μL的参数设置下, 测得该方法的检出限为0.003μg/kg, 定量限为0.01μg/kg, 加标试样回收率为93.1%～106.0%, 精密度为0.99%～1.98%。该方法操作简便、回收率高、检测时间短, 为乳制品中AFM1检测提供了参考价值。丁俭等[35]利用在线固相萃取富集结合高效液相色谱建立了能够快速检测牛奶中AFM1的方法。牛奶样品直接进样, 以乙腈-水（15∶85, 体积比）作为流动相, 6次加标回收率为98%～105.7%, 检出限为0.04μg/kg, 具有操作简便, 耗时短的优点。ShifaShuib等[36]建立了一种柱后光化学衍生法与HPLC相结合的检测方法, 无需使用危险的化学溶剂, 衍生程序自动化, 增加了AFM1的荧光性以提高灵敏度, 可检测出低于欧盟限量标准的AFM1含量, 并提出该方法可扩展到同时测定其他黄曲霉毒素, 见表4。

表4 HPLC检测黄曲霉毒素

2.1.3 高效液相色谱-串联质谱技术（HPLC-MS/MS）

近些年被广泛应用的色谱质谱联用技术既保留了液相色谱的高分离性能, 又增加了质谱的高灵敏度及其对相对分子质量的强筛选能力, 能做到同时对多种真菌毒素进行定性和定量分析, 已成为目前主流的检测技术。因为该方法能够克服检测过程中杂质峰的干扰, 有助于化合物的准确定性定量。华宇等[37]建立了乳粉中AFM1的液相色谱-质谱联用检测方法。该方法省去了国标中用10 mL水淋洗净化柱以及用乙腈或甲醇洗脱亲和柱的过程, 回收率在85.64%～120.14%, 相对标准偏差为2.08%～5.14%, 定量限为0.06μg/kg, 检出限为0.02μg/kg。实验结果表明该方法在较高检测准确度的前提下, 不仅节省溶剂, 还缩短了前处理时间。陈慧玲等[38]在测定液体奶及奶粉中AFM1的验证方法中应用了液相色谱-串联质谱的检测方法, 该方法检出限为0.003μg/kg,定量限为0.01μg/kg, 并实际检测了55份市售样品,检出率为20%,表明该方法实用可靠,见表5。但这一检测技术目前还存在所需仪器昂贵, 样品前处理繁琐耗时长等缺点, 仍有待提高改进之处。

表5 HPLC-MS/MS检测黄曲霉毒素

2.2 免疫分析技术

2.2.1 酶联免疫吸附法(ELISA)

该方法的优势在于操作简单安全, 但由于酶是高活性物质, 稳定性不强, 容易造成假阳性和假阴性结果。孙清等[39]通过以辣根过氧化物酶（HRP）标记的AFB1作为竞争抗原, 成功制备了能与进口试剂盒检测结果相比的能同时检测液态奶、酸奶和奶粉中AFB1和AFM1的ELISA试剂盒, 该试剂盒的最低检测限（IC10）为37 pg/mL, （IC50）为211 pg/mL, 在加标回收实验中回收率在87.9%～109.1%之间, 批内相对标准偏差在3.9%～10.8%之间。李江等[40]用酶联免疫法测定样品中AFB1和AFM1, 用60%甲醇-水提取样品, 1∶4纯水稀释, 选取加标浓度为0.2、0.4和0.8μg/kg做3个平行。测得此方法对AFB1和AFM1的回收率结果均在90%～110%之间, 方法快速稳定, 适用于乳制品中AFB1和AFM1的检测。裴世春等[41]自主开发的抗AFM1单克隆抗体偶联HRP后建立了直接竞争-酶联免疫吸附（dc-ELISA）检测AFM1体系, 采用MD6无血清培养基经高密度培养分泌抗AFM1单克隆抗体杂交瘤细胞后获得高纯度抗AFM1单克隆抗体, 并利用AFM1污染标准物质对检测体系灵敏度和精确性进行验证。结果显示dc-ELISA可满足鲜乳中AFM1国家残留限量标准0.5μg/kg的检测要求。该该体系可应用于鲜奶制品中AFM1大于0.5μg/kg污染样品的快速初筛。Bolong等[42]开发了一种间接竞争性等离子体酶联免疫分析法, 用葡萄糖氧化酶（GOX）诱导金纳米棒（AuNRs）的氧化还原反应, 氧化石墨烯诱导金纳米棒的显色反应达到对牛奶中AFM1进行定性和定量检测的目的。该方法特异性高, 回收率高, 灵敏度高, 见表6。

表6 ELISA检测黄曲霉毒素

2.2.2 胶体金免疫层析法（GIGA）

胶体金免疫层析法是20世纪80年代发展起来的一种快速免疫分析技术, 利用纳米金作为标记物与待测物质结合被相应配体捕获的原理进行定性或定量测定[43]。其最大缺点为试纸条和试剂盒保存时间有限, 在常温下不能长久保存。武玉香等[44]建立了定性测定羊奶中AFM1胶体金免疫层析试纸条, 检测限达到0.5μg/L, 检测结果显示与其他结构类似物的交叉反应率低于5%, 与不同族的其他物质的交叉反应率小于1%, 假阳性率小于5%, 假阴性率为0, 满足国家标准的规定。吴成辉等[45]建立了新型的“双检测限”胶体金免疫层析试纸条, 一步就能快速检测筛查牛奶中AFM1的含量是符合中国还是欧盟的限量标准, 检测灵敏度达到0.05 ng/mL。在与ELISA比对试验中, 本方法与其显示出了较高的一致性, 可用于基层AFM1的现场快速筛查。罗晓琴等[46]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,将单克隆抗体胶体金标记物冻干成微孔试剂。所研制的黄曲霉毒素M1快速检测试纸条的检测限为0.3μg/L,检测时间为10 min,假阳性率和假阴性率为0。试纸条使用简单方便,适合进行现场快速检测牛奶中残留的黄曲霉毒素M1。黄艳梅等[47]采用EDC/NHS法制备了偶联抗AFM1单克隆抗体的免疫磁珠与待检样品混合,能够很好地分离目标物,并用免疫层析试纸条检测,检出限为0.1μg/L,适用于乳品中AFM1的快速检测, 见表7。

表7 GICA检测黄曲霉毒素

3 结论

为确保市场上乳制品的安全, 提高黄曲霉毒素的检测能力已成为保障食品安全和人类健康的迫切需求。目前各种检测技术基本成熟。对于某类样品基质中单个或一类真菌毒素的分析检测方法有很多, 未来可以从简化乳品前处理方法、研制便携式、能快速对大量样品做定量检测的检测设备以及建立一种一次性同时检测某种样品基质中多种真菌毒素的方法这些方面进行探索, 开发高通量、低成本的检测方法。