梁玉洁，邹俊波，张小飞，彭 磊，张 雪，陈志泽，郭东艳，杨艳君，周 晓，刘 琳，史亚军*，雷根平

1.陕西中医药大学药学院，咸阳 712046；2.陕西中医大学附属医院，咸阳 712046

润肺宁神方由当归、生白芍、柴胡、茯神、炒白术、炙百部、合欢皮、川芎、酸枣仁、知母与炙甘草11种药材组成，用于治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)引起的失眠。处方中当归、甘草为君药，具有抗抑郁、平喘[1-2]的功效；合欢皮、柴胡为臣药，具有镇静催眠抗抑郁、抗失眠[3-4]的功效，酸枣仁养血安神、平肝理气，善治虚烦不眠[5]。

本文通过网络药理学方法和分子对接技术对润肺宁神方进行分析，并探讨其治疗COVID-19致失眠的机制，为其今后的治疗提供参考。

1 方法

1.1 药材成分靶点筛选

在TCMSP平台(https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)以类药性(DL)和生物利用度(OB)作为筛选条件，检索白术、柴胡、川芎、当归、茯神、甘草、合欢皮、生白芍、酸枣仁、知母和炙百部的潜在成分和靶点信息，以Batman(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)和CTD(https://ctdbase.org/)数据库作为补充，检索药材其余靶点信息。

1.2 疾病靶点筛选

以“Sleep Initiation and Maintenance Disorders”、“COVID-19”为关键词在Disgenet、GeneCards、CTD和Malacards数据库中(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET、https://www.genecards.org、https://ctdbase.org、https://www.malacards.org)搜索，在GeneCards数据库中以Score≥5.04、CTD数据库中以Score≥25.04为筛选条件，得到失眠相关的靶点信息，将3个数据库搜集的靶点去重，得到失眠的相关基因。在CTD数据库中以Score≥6为筛选条件，得到COVID-19相关靶点信息，将3个数据库搜集的靶点去重，得到COVID-19的相关基因。

1.3 成分-靶点-疾病网络构建

利用Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)导入22个疾病删去重复值的靶点，取交集，得到两者共有靶点。导入药材和2个疾病交集靶点，取交集，得到疾病和药材共有靶点。在Excel表格中建立成分-靶点、疾病-靶点关系表，导入Cytoscape 3.2.1软件，构建出成分-靶点-疾病网络图。

1.4 靶点相互作用网络的构建

将Cytoscape筛选出的潜在靶点导入STRING网络平台上(https://string-db.org/)，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”，构建蛋白相互作用(PPI)网络图。用Cytoscape 3.2.1软件，导入蛋白相互作用.tsv文件，用度值筛选出润肺宁神方治疗失眠的核心靶点。

1.5 GO分析和KEGG通路富集

在R软件平台安装Cluster Profiler软件包，对核心靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析，再利用R平台构建交互网络。

1.6 分子对接

在处方治疗COVID-19致失眠的网络图中选取5个核心靶点，用PDB数据库(https://www.rcsb.org/)找出Score值靠前的靶点蛋白结构，配体是对应于靶点的化合物。在Drugbank平台(https://go.drugbank.com/)找到靶点对应的阳性药并在Pub Chem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载阳性药物和靶点对应化合物的2D结构，将靶点3D结构、阳性药2D结构和对应化合物导入Discovery Studio，用DOCK ligand(libDock)进行分子对接，得到靶点、阳性药和化合物的相互关系图。

2 结果与分析

2.1 药材成分靶点筛选结果

根据数据库的检索结果得到润肺宁神方中共有药材成分349种，其中白术17种、柴胡17种、川芎11种、当归120种、茯神5种、甘草92种、合欢皮15种、生白芍13种、酸枣仁12种、知母15种和炙百部32种。11种药材去除重复值后包括靶点1 904个。

2.2 疾病靶点筛选结果

失眠靶点在Genecards数据库中以Score≥5.04为条件找到相关靶点176个；在CTD数据库中以Score≥25.04为条件找到相关靶点1 208个；Disgenet数据库中找到15个，3个数据库去除重复靶点后共有1 337个。COVID-19靶点在Genecards数据库找到339个；在CTD数据库中以Score≥6为条件找到相关靶点1 250个；在Malacards数据库中找到10个，3个数据库去除重复靶点后共有1 505个。将2个疾病靶点导入Venny 2.1.0作图，共有交集靶点404个，见图1，疾病与药材交集250个，见图2。

图1 疾病与疾病之间的共同靶点

图2 疾病与药材之间的共同靶点

2.3 成分-靶点-药材网络构建分析

将成分-靶点、疾病-靶点关系表导入Cytoscape 3.2.1中，用Network Analyer计算出平均值为9.358，取平均值和最大值为区间，选出核心靶点构建成分-靶点-药材网络。网络图包括节点138个，边线969条，见图3。由图3可知处方治疗COVID-19致失眠为多成分、多靶点的联合作用。

图3 成分-靶点-药材网络

2.4 靶点相互作用网络的构建分析

将药材和疾病的共同靶点上传至String中，Organism设置为Homo sapiens，得蛋白与蛋白相互作用PPI网络，见图4，该网络有59个节点、671条相互作用关系，平均度值22.7。下载PPI网络数据.tsv文件，将其导入Cytoscape 3.2.1中以Degree值排序，选出平均度值大于22.746的核心靶点33个，见图5，节点越大表示其相关性越强、越重要。其中最为重要的有AKT1、INS、TP53、IL-6、JUN、CASP3、TNF、CAT、PTGS2和CXCL8等。

图5 靶点与靶点相互关系

2.5 GO分析和KEGG通路富集分析

用R语言的Cluster Profiler软件执行GO和KEGG，共富集并排列了2 430条路径，其中KEGG有170条路径，前10条路径见表1。COVID-19致失眠病理发展与人类巨细胞病毒感染、流体剪切应力与动脉粥样硬化及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等有关。见图6和表2，可以了解到这些路径上的靶点如ATK1、RELA、IL1B、CXCL8和CASP3等是同时作用于许多不同的路径。通过Cluster Profiler软件包构建围棋交互网络，该网络反映了围棋术语之间的关系，见图7，圆点颜色越红越大表示该路径与病理发展越明显。

表1 KEGG通路富集前10条路径

图6 疾病、药材靶点的KEGG相互作用网络

表2 数字所表示的靶点

图7 核心靶点调控网络

GO分析可分为细胞组分(cellularcomponent, CC)、分子功能(molecular function, MF)和生物过程(biological process, BP)3部分。GO分析结果在生物过程中富集2 114条路径，在细胞组分中富集41条路径，在分子功能上富集了105条路径，表3列举了前10条路径。

表3 GO分析BP、CC、MF前10条路径

表3(续) GO分析BP、CC、MF前10条路径

2.6 分子对接分析

为进一步研究机制，选取网络图中度值排名靠前的5个核心靶点PTGS2、AR、PPARG、NOS2和HSP90AA1，并将靶点对应的化合物进行分子对接，得分越高表示其结合活性越高，结果见表4。其中PTGS2与β-谷甾醇、AR与1-甲氧基菜豆素、PPARG与1-甲氧基菜豆素、NOS2与3′-羟基-4′-O-甲基光甘草定以及HSP90AA1与脱水淫羊藿素结合活性高。用Discovery Studio进行阳性药物验证和分子对接，并选取表4中得分最高的化合物与阳性药物比较，结果见表5。核心靶点与核心成分、阳性药物的对接结果见图8，可以看出，5个核心靶点与核心成分对接的得分结果均高于与阳性药物的分数。

表4 核心靶点与对应化合物结合活性得分

表4(续) 核心靶点与对应化合物结合活性得分

表5 核心靶点与核心成分、阳性药物的结合活性得分对比

注：A.PTGS2-塞来昔布；B.PTGS2-β-谷甾醇；C.AR-7-羟基-4-甲基-3-(2-羟基乙基)香豆素；D.AR-1-甲氧基菜豆素；E.PPARG-二十碳五烯酸；F.PPARG-1-甲氧基菜豆素；G.NOS2-瓜氨酸；H.NOS2-3′-羟基-4′-O-甲基光甘草定；I.HSP90AA1-格尔德霉素；J.HSP90AA1-脱水淫羊藿素。

3 讨论

由新型冠状病毒感染所致的COVID-19具有传染性强、传播迅速、死亡率高等特点，严重危害人类健康[6]。疫情爆发后，雷根平院长作为陕西援鄂抗疫中医医疗队队长，在江夏方舱医院开展抗疫工作，提出了分别针对COVID-19病人不同症状的江夏系列方，用过处方的大多数患者症状都有了显著改善。

国际疾病分类第十版将失眠定义为睡眠启动和维持障碍以及早醒[7]。中医认为引起失眠的原因是阴衰阳盛、心脾肝肾气血不足[8]。本研究通过网络药理学利用多种生物学信息库以及Cytoscape软件等构建了润肺宁神方和失眠的成分-靶点-药材网络和靶点相互作用网络，并对关键节点和重要通路进行富集分析。通过以上研究发现，润肺宁神方成分主要集中在人类巨细胞病毒感染、流体剪切应力与动脉粥样硬化、AKT1、INS、TP53、IL6、JUN、CASP3、TNF、CAT、PTGS2和CXCL8等通路或靶点。

人类巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)与机体免疫功能和神经功能相关[9-10]，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)与血管损伤、炎症反应和动脉粥样硬化息息相关，通路激活可导致活性氧过量产生、NF-κB活化、黏附分子和细胞因子表达增加[11]，NF-κB可使IL-6和TNF-α释放增加。ATK1是一组蛋白质合成信号靶蛋白，通过评估发现，AKT1可通过调节相关通路增加肌蛋白合成，恢复呼吸肌，还可抑制AKT磷酰化，减少支气管平滑肌增殖，从而减轻气道重塑[12-13]。ATK1参与代谢、增殖、生长以及血管的生成等过程的调节。研究表明AKT1多态性在汉族人抑郁症、焦虑症方面起重要作用[14]。研究发现，被流感病毒感染的肺部，致炎因子激活中性粒细胞和单核细胞，释放TNF炎性细胞因子使机体发生炎性细胞反应和组织损伤。TNF可促进内皮细胞黏附因子的表达分泌并促使白细胞与之黏着，还能激活间质组织蛋白水解酶的释放及中性粒细胞的聚集，从而发挥治疗疾病作用[15]。TNF-α为参与炎症过程的关键因子之一，参与机体免疫、炎症反应、抗肿瘤、神经元调控等过程，是免疫和神经系统的连接信使，通过炎症因子的释放可以使免疫系统调节睡眠，失眠可导致体内TNF-α含量变高，通过调节体内TNF-α含量可以改善睡眠。IL-6是具有抗炎和促炎功能的细胞因子，在中枢神经系统的病理损害过程和促进大脑释放神经生长因子上均发挥作用。IL-6在人体的分泌与睡眠规律一致，与睡眠的正常密切相关[16]。IL-6还可诱导T细胞分化，促进炎性诱导因子释放，参与肺炎病理过程[17]。

为了进一步说明靶点蛋白与其配体化合物的结合活性，选取润肺宁神方治疗COVID-19致失眠网络图中度值前5个靶点PTGS2、AR、PPARG、NOS2与HSP90AA1。在DrugBank中找到靶点对应的5个阳性化合物塞来昔布、7-羟基-4-甲基-3-(2-羟基乙基)香豆素、二十碳五烯酸、瓜氨酸和格尔德霉素。靶点对应的成分化合物是该靶点的配体。分子对接结果表明蛋白与配体的结合活性高于阳性药的得分。在这些核心靶点中，PTGS2参与前列腺素E2生产的重要过程，前列腺素E2在运动性调节、增殖、抗凋亡等方面发挥重要作用，可在炎症因子的诱导下增加表达量。PPARG是过氧化物酶体增殖物激活受体亚家族的成员，该基因编码的蛋白质参与免疫、炎症等过程[18]。HSP90AA1蛋白在抑郁患者中表达增加[19]。作为一氧化氮合酶的NOS2表达异常时可使NO含量升高，启动机体氧化应激，加重炎症反应[20]。

有证据表明，山柰酚对急性肺损伤等炎性症状有潜在的治疗作用[21]。山柰酚、槲皮素均有镇静、催眠作用[22-23]。槲皮素可以通过抑制炎症因子的表达发挥抗炎作用，抑制TNF-α降低炎症水平[24]。异鼠李素具有抗炎作用，可通过抑制TNF-α、IL-6发挥保护急性肺损伤的作用[25]。β-谷甾醇可抑制TNF-α的生成与释放发挥抗炎作用[26]。β-谷甾醇可以顺利透过血脑屏障，沉积于脑细胞膜上。还可通过增加去甲肾上腺素、5-羟色胺及其代谢产物改善抑郁症状[27]。

综上所述，润肺宁神方治疗COVID-19致失眠的机制可能是通过槲皮素、山柰酚、异鼠李素、β-谷甾醇等化学成分作用于IL-6细胞因子、抑制TNF-α的释放等。推测润肺宁神方通过抑制IL-6、抑制TNF-α等发挥治疗COVID-19致失眠的作用。预测了处方治疗疾病的潜在靶点和生物过程及其机制。由于网络药理学的局限性，后期仍需对COVID-19致失眠及其相关治疗药物进行全面深入地研究。