李 齐 安子宜 董泽嵩 刘洪凤 李 姝 毕鹏翔 霍楠楠 朱晓峰*

（1.牡丹江医学院生化教研室，黑龙江 牡丹江，157011；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯，154000；3.开滦总医院检验科，河北 唐山，063001；4.丽水市中心医院检验科，浙江 丽水 323000；5.牡丹江医学院附属红旗医院神经科，黑龙江 牡丹江，157011）

酒精依赖综合征，是现今最为常见的物质依赖疾病之一。到目前为止，酒精依赖的患病人数仅次于尼古丁依赖综合征，已经成为全球第二大的成瘾物质，全球大约有4.9%（约2.4亿）的人群受到影响。因为酒精病死的人数约占总病死人数的5.9%。根据2015年全球疾病研究发现，发达国家的致残致死的5个重要原因之一就是酒精依赖。中国流行病学研究显示，我国酒精依赖和滥用问题也在日益增多，酒精依赖的研究也随之增多。现今国内外最常使用的构建酒精依赖大鼠模型的模式主要包括灌胃、自由饮、腹腔注射等方式。本研究通过大鼠自由饮方式，构建了2种不同酒精浓度的酒精依赖大鼠模型，为酒精依赖综合征的相关研究提供了科学模型方面的实验根据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

本研究选取6周龄、体质量180～200 g、SPF级雄性SD大鼠30只，购于牡丹江医学院动物房[SYXK（黑）2019-003]。动物模型构建及其相关检测在牡丹江医学院SPF级实验动物中心鼠类实验室[SYXK（黑）2019-006]进行。全部大鼠的饲养和使用都按《国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》进行操作，并且符合牡丹江医学院实验动物管理条例。

1.1.2 试剂及仪器

无水乙醇（生产企业：深圳迈瑞公司）；高架十字迷宫（生产企业：上海移数信息科技有限公司）；Morris水迷宫视频分析系统（生产企业：成都泰盟软件有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 酒精依赖大鼠模型的构建

将30只大鼠单笼饲养，室温维持在22～24 ℃，光照/黑暗周期为12 h/12 h，环境湿度55%左右。实验之前使用随机数表法将大鼠分为3组，每组10只，即对照组（a组），10%自由饮酒精依赖模型组（b组）和20%自由饮酒精依赖模型组（c组）。3组大鼠均每周更换垫料，并对其体质量进行称量记录。其中a组双瓶蒸馏水自由饮喂养。b组在适应性喂养1周后，开始建模喂养，实验过程中饮食正常，饮水则是每个笼内放置2个饮水瓶。2个水瓶分别是10%酒精溶液和蒸馏水，构建模型期间，每天早上8：00分别测量饮酒量（mL/24 h）和饮水量（mL/24 h），并记录饮酒及饮水的数据。为了避免形成位置偏差，每天必须要交替更换酒瓶和水瓶的位置。所有蒸馏水和10%酒精溶液必须更新1次/d，持续造模4周，共28 d。c组同b组一样，在适应性喂养1周后，开始建模喂养，实验过程中饮食正常，饮水则是每个笼内放置2个饮水瓶。第1天8：00双瓶分别为20%酒精溶液和蒸馏水，第2天8：00分别测量饮酒量（mL/24 h）和饮水量（mL/24 h），并且将装20%酒精的水瓶替换为蒸馏水瓶，即第2 天大鼠饮用的是双瓶蒸馏水，如此反复进行交替。为了避免形成位置偏差，每次必须要交替更换水瓶和酒瓶的位置。所有蒸馏水和20%酒精溶液必须更新1次/d，持续造模4周，共28 d。

1.2.2 酒精偏好的测定

构建模型成功后，计算b组和c组的酒精偏好。计算酒精偏好主要是为了掌握大鼠每天消耗的酒精量占了总液体（酒精+蒸馏水）的消耗量百分比，也就是酒精偏好（%）=酒精的消耗总量（mL）/（酒精的消耗总量+水的消耗总量）（mL）×100%。

1.2.3 高架十字迷宫检测（Elevated plus maze，EPM）

在最后1次饮酒24 h后，把30只大鼠放置在室温恒定（24 ℃）、室内光线昏暗恒定的测试实验室中，全程保持安静，对3组大鼠完成高架十字迷宫的测试。十字高架位于地面上方的65 cm处，由2条开放臂、2条闭合臂以及中央区共同组成。点击EPM测试系统，设置本次测试实验的参数（包括开放臂和闭合壁进入次数、开放臂和闭合壁滞留时间、动物运动总距离等），完毕后，把大鼠放置在设备“十”字正中央位置，每只大鼠的测试时间为3 min。每次检测完毕后，一定要使用乙醇棉球对整个设备擦拭，然后再继续进行下一只大鼠测试。实验参数：开放臂进入次数（OE，次）：即大鼠进入到EPM任意一条开放臂的次数，每次活动的开始是以该鼠的4个爪都进入到开放臂内或者大鼠躯体约有80%进入臂内开始，在实验中途有1个爪从该开放臂中完全撤出即认为本次的进入活动结束；开放臂滞留时间（OT，s）：即大鼠进入到开放臂中所停留的时间；总路程（cm）：即大鼠在十字高架中行动的总距离。数据分析使用EPM自带的动物行为学软件完成。大鼠进入任意一条开放臂的次数越少，在开放臂里滞留的时间越短，则说明大鼠焦虑情况越加的严重。

1.2.4 水迷宫测试（Morris water Maze，MWM）

Morris水迷宫圆形的水池池壁，黑色的池底，在水池的四周挂避光的窗帘，对实验区域光线进行遮挡。水池根据实验等分成为四个区域（即四个象限）。第一象限的中间放置一个水面以下0.5 cm 的平台，平台可以被拆除。每次实验都需要将大鼠移开，并用吹风机将其吹干，放回笼内。Morris水迷宫可以用来检测酒精自由饮模型的学习与记忆能力（包括空间探索实验和定位航行实验）。定位航行实验需要连续进行4 d，固定时间段训练，2次/d，每次训练时间间隔15 min，游泳训练时间为60 s/次，每次训练要从池壁4个起始点的任一点将大鼠面向池壁放入水池。如果大鼠在60 s内能够找到平台，就让它呆在平台上30 s，加强大鼠的学习记忆；如果60 s内未找到平台，就把它用工具引导到平台上并且使其停留30 s。以大鼠每天每次到达路径长度（游泳距离）和平台的时间（潜伏期）进行测量，如果游泳距离和潜伏期越短，则说明其学习能力越强。空间探索实验是需要在定位航行实验结束之后24 h进行，对动物空间位置记忆的保持能力进行测量，只需要进行1次。定位航行实验和本次实验的差异在于要将水面高度调节到预定的高度之后需要移除平台，大鼠在目标象限的对侧放出，游泳时间延长为120 s。在空间探索实验中，记录大鼠在目标象限的停留时间和穿越目标象限的次数。穿越平台次数越多，在平台所在象限游泳停留时间越长，就说明大鼠学习能力越强。

1.2.4 酒精戒断综合征评分（scores of ethanol withdrawal syndrome，EWS）

根据Motaghine-jad M等的方法，在最后1次饮酒24 h后对3组大鼠进行改良酒精戒断行为学的观测评分，30只大鼠都需要在同一环境下进行评分观测。观测项目包括了5个项目和总评分，即刻板行为、激惹性、尾巴强直、异常姿势和听源性癫痫发作情况以及总评分，其中5个项目相加为总评分，每个项目的评分增高说明戒断的症状在加重。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 10%酒精依赖模型组和20%酒精依赖模型组的体质量、饮酒量和饮酒偏好

2.1.1 3组大鼠体质量比较

实验前，3组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（F=1.206，P=0.315）。实验结束时，饮酒组（b组和c组）与对照组（a组）大鼠体质量比较，差异无统计学意义（F=0.905，P=0.416）。见图 1。

图1 3组大鼠体质量变化情况

2.1.2 建模期内3组大鼠饮酒量、饮水量和酒精偏好

在双瓶（酒精+蒸馏水）自由饮喂养模式下，b组在经历了连续28次双瓶自由饮，在最后7 d的酒精摄入量（16.80±0.63）mL/24 h保持稳定，饮水量（11.90±0.39）mL/24 h稳定，酒精偏好稳定在（57.74±1.83）%，差异无统计学差异（F=1.762，P=0.121）。见图2（A和B）。c组在经历了14次循环（28 d）间歇性双瓶饮时，酒精的摄入量逐步增多，直至达到平台期（16.65±1.31）mL/24 h，而饮水量伴随着饮酒量的增多而减低，直至稳定在了（10.30±0.98）mL/24 h，酒精偏好增加至（61.77±2.81）%。见图3（C和D）。

图2A b组大鼠最后7 d饮酒量、饮水量

图2B b组大鼠最后7 d酒精偏好变化

图3C c组大鼠饮酒量、饮水量

图3D c组大鼠酒精偏好变化

2.2 高架十字迷宫测试（EPM）比较各组行为学变化

在b、c组最后1 d饮酒后24 h，对3组大鼠进行EPM检测。与a组比较，2组模型组在EPM测试中，其开放臂探索次数和时间均明显减少，b组开放臂探索次数更少，差异有统计学意义（t=7.946，P＜0.05），开放臂探索时间更短，差异有统计学意义（t=13.021，P＜0.05）；c组开放臂探索次数更少，差异有统计学意义（t=7.589，P＜0.01），开放臂探索时间更短，差异有统计学意义（t=16.045，P＜0.05）。3组大鼠总运动距离分别为（999.12±3.24）cm、（1 001.01±3.95） cm 和（999.98±3.67）cm，差异无统计学意义（F=0.680，P=0.515）。以上结果说明，酒精依赖大鼠在酒精戒断后能够出现焦虑行为，但酒精对大鼠的运动能力无明显的影响。高架十字迷宫的测试结果。见表1。

表1 3组大鼠高架十字迷宫实验结果比较 （）

2.3 3 组大鼠水迷宫实验结果

2.3.1 3 组大鼠游泳总距离和潜伏期比较

在定位航行实验进行中，与a组相比，b组、c组大鼠记忆和学习能力明显下降，其游泳总距离明显变短，潜伏期也明显缩短，其中实验第2天，b组、c组与a组相比，差异有统计学意义（t=-4.344，P＜0.05；t=-2.320，P＜0.05）；实验第3天，b组、c组与a组相比，差异有统计学意义（t=-4.321，P＜0.05；t=-2.964，P＜0.05）；实验第 4天，b组、c组与a组相比，差异有统计学意义（t=-5.090，P＜0.05；t=-4.117，P＜0.05）。见表 2、表 3。

表2 3组大鼠在4 d实验日潜伏期比较 （，s）

表3 3组大鼠在4 d实验日游泳总距离比较 （，cm）

2.3.2 3组大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间比较

实验第5天，MWM进行空间探索实验，与a组比较，b组、c组在目标象限（即第一象限）滞留时间变少，差异有统计学意义（t=5.254，P＜0.05；t=4.011，P＜0.05）；与 a组比较，b组、c组平台穿越次数明显下降，差异有统计学意义（t=3.517，P＜0.05；t=3.591，P＜0.05）。见表4。

表4 3组大鼠目标象限滞留时间和穿越平台次数比较 （）

2.4 酒精戒断评分对大鼠的戒酒症状的评价

b组、c组在饮酒期间很温顺，不容易被激惹，并很少会出现攻击性行动。与a组（2.50±0.71）分比较，b组（11.05±0.97）分、c组（12.10±0.99）分在戒酒24 h的戒断总评分明显升高，差异有统计学意义（t=-23.681，P＜0.05；t=-24.878，P＜0.05）。见图 4。

图4 3组大鼠的酒精戒断综合征评分比较

3 讨论

构建成功的实验动物模型是进行科学研究的第一个非常关键的步骤。国内外在构建酒精依赖模型的时候多会选用灌胃、腹腔注射以及自由饮的方法，各有优缺点。根据文献分析，酒精依赖的大鼠模型假如用自由饮模式进行模型的构建，则会避免对大鼠腹腔连续注射酒精而引起的感染，以及灌胃大鼠致使的上消化道不适，从而降低了造模大鼠的死亡率。同时，自由饮构建酒精依赖模型更符合人的饮酒方式，更适合做后续酒精依赖实验研究。但是自由饮模型也有缺陷，即动物对酒精的喜好影响了模型的构建。因此，本研究选择雄性大鼠进行实验，在构建模型后，对模型进行行为学测试，筛选出已经成功的模型。目前自由饮构建模型的方法很多，本研究选用大鼠来制备10%双瓶自由连续性饮酒模型组和20%双瓶自由间歇性饮酒模型组。结果表明，以上2种不同的制备模型方法都能达到实验要求，10%双瓶自由连续性饮酒模型组在最后7 d的酒精摄入量保持稳定，酒精偏好稳定，该实验的结果和Sona Khan M等构建动物自由饮模型的结果接近；20%双瓶自由间歇性饮酒模型组在通过28 d间歇性酒精造模，其酒精摄入量在逐步增多，最后到达平台期，该实验的结果和Hwa L S等构建动物自由饮模型的结果相类似。EPM中2组模型组与对照组相比较发现，在开放臂中探索时间与次数均明显降低。在水迷宫实验中，大鼠记忆和学习能力明显降低，即说明长时间的饮酒，会导致记忆和学习能力明显下降。通过自愿饮酒量的增加，以及酒精偏好的增加，提示了本实验已经成功建立大鼠的酒精依赖模型，大鼠的行为学测试也说明自由饮的造模效果很好。

综上所述，10%持续自由饮和20%间断自由饮的建模方法均可以进行酒精依赖的后续相关的动物实验研究。