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替格瑞洛对急性心肌梗死小鼠心肌的保护作用及机制研究*

2022-10-24宋占春何廉旗任智超

重庆医学 2022年19期
关键词:预处理染色心肌

宋占春,陈 亮,何廉旗,张 迪,任智超,张 建

(辽宁省抚顺市中心医院:1.心内科;2.普通外科 113006)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是一种突发严重的缺血性心脏病,严重威胁着人类生命健康。心肌梗死部位炎症细胞的浸润与活化在AMI过程中发挥重要作用,尤其以巨噬细胞浸润为主[1]。替格瑞洛(ticagrelor)是一种新型血小板抑制剂,通过和P2Y12受体结合,抑制血小板活性,防止冠心病患者发生血栓事件,但目前对替格瑞洛的其他药理功能仍知之甚少[2-3]。据报道,替格瑞洛可抑制巨噬细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎症小体的激活,进而抑制炎症反应的发展[4]。在AMI中,通过抑制巨噬细胞浸润和NLRP3炎症小体激活可明显改善心肌功能,发挥对AMI的治疗作用[5-6]。研究表明,P2Y12受体被抑制可促进血管平滑肌细胞自噬,进而改善动脉粥样硬化进程[7]。而在AMI中,促进心肌细胞自噬可缓解疾病进程[8]。推测替格瑞洛可能通过影响NLRP3炎症小体激活和细胞自噬作用调节巨噬细胞浸润在AMI中发挥保护作用。因此,本实验对替格瑞洛在小鼠AMI模型中的作用开展研究,以期为临床开发治疗AMI的有效药物提供新的方向和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

8周龄雄性C57BL/6小鼠30只(辽宁长生生物技术股份有限公司),体重22~22 g;替格瑞洛(T125095);小鼠肌钙蛋白(cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)ELISA检测试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司);肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-18 ELISA试剂盒[联科集团(中国)有限公司];CD68抗体、P62抗体、pro-IL-1β(武汉爱博泰克生物科技有限公司);NLRP3抗体、半胱天冬酶-1(caspase-1)抗体、cleaved IL-1β抗体、微管相关蛋白1轻链3(LC3)抗体、Beclin-1抗体、p62抗体、β-actin抗体(沈阳万类生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠AMI模型建立及药物干预

将8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为5组:假手术组(sham组)、AMI组、替格瑞洛治疗组、替格瑞洛预处理组、替格瑞洛预处理+治疗组。除sham组外,其余各组小鼠均采用左前降支冠状动脉结扎的方法建立AMI模型。小鼠术前禁食禁水12 h后,麻醉,剃胸毛,消毒。切开皮肤,用钝器剥离肌肉,切开心包,露出心脏。结扎冠状动脉左前降支,观察到结扎端苍白,表明结扎成功。替格瑞洛治疗组建模成功后每天同一时间给予替格瑞洛(27 mg/kg),灌胃7 d;替格瑞洛预处理组于建模前7 d每天同一时间给予替格瑞洛(27 mg/kg),灌胃7 d;替格瑞洛预处理+治疗组于建模前7 d至建模后7 d持续每天同一时间给予替格瑞洛(27 mg/kg)灌胃。sham组和AMI组为对照组,给予与实验组等量生理盐水灌胃。到达时间点后取小鼠血清、心肌组织,并统计心脏质量和小鼠体重。

1.2.2超声心动图检测

采用美国GE Voluson E8四维彩超仪对各组小鼠进行超声心动图检测,计算心脏功能相关指标,包括左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、短轴缩短率(FS)、射血分数(EF)。

1.2.3ELISA检测cTnⅠ水平、CK-MB和LDH活性

将各组小鼠全血室温放置2 h后,1 000×g离心20 min,获得血清标本。参考ELISA试剂盒说明书,检测血清cTnⅠ水平、CK-MB和LDH活性。

1.2.4苏木素-伊红(HE)染色

对心肌组织切片进行常规HE染色,梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封片。于显微镜下观察染色效果并拍照。

1.2.5心肌组织炎症指标检测

取小鼠心肌组织,冰浴匀浆后,1 000×g离心10 min,取上清液进行检测。按照ELISA试剂盒说明书,检测小鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-18表达水平。

1.2.6免疫荧光染色

将心肌组织脱水包埋切片。使用山羊血清室温封闭15 min,加入一抗(1∶100稀释)4 ℃孵育过夜。次日,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后,滴加荧光二抗(1∶200稀释)室温孵育60 min,PBS清洗后,晾干,盖玻片封片。于荧光显微镜下观察染色效果并拍照。

1.2.7Western blot检测蛋白水平

取小鼠心肌组织,冰上研磨后,于细胞裂解液静置30 min,12 000 r/min,4 ℃,离心20 min,上清液为蛋白质抽提物。采用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量,40 μg蛋白上样,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脱脂奶粉封闭1 h后,放入一抗,4 ℃孵育过夜。次日,辣根过氧化物酶标记IgG(IgG-HRP)二抗室温孵育45 min后,电化学发光法(ECL)底物发光,采用凝胶图像处理系统分析目标条带光密度值。

1.2.8透射电镜观察

将心肌组织于电镜固定液固定后,依次进行室温脱水、渗透包埋、聚合、超薄切片。于2%醋酸铀饱和乙醇溶液避光染色8 min,70%乙醇及超纯水各清洗3次,2.6%枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8 min;超纯水清洗后,室温干燥过夜。于透射电子显微镜下观察染色效果,镜下采集图像分析。

1.2.9统计学处理

2 结 果

2.1 替格瑞洛对AMI小鼠模型心脏功能的影响

与sham组相比,造模成功后AMI组小鼠心脏LVIDd、LVIDs均明显增加(P<0.01),FS、EF均明显降低(P<0.01)。与AMI组相比,替格瑞洛治疗组、替格瑞洛预处理组和替格瑞洛预处理+治疗组上述指标均出现不同程度恢复(P<0.05或P<0.01),其中,替格瑞洛预处理+治疗组恢复效果优于替格瑞洛治疗组和替格瑞洛预处理组(P<0.01),见表1。

表1 小鼠超声心电图各参数结果比较

与sham组相比,AMI组小鼠血清cTnⅠ水平、CK-MB和LDH活性及心脏质量/体重比值均明显增加(P<0.01)。与AMI组相比,替格瑞洛预处理组和替格瑞洛预处理+治疗组上述指标均明显降低(P<0.05或P<0.01),替格瑞洛治疗组除心脏质量/体重比值,其余各项指标均明显降低(P<0.05),见表2。

表2 小鼠血清cTn I水平、CK-MB和LDH活性及心脏质量/体重比值比较

2.2 替格瑞洛对AMI小鼠模型心肌组织病理变化的影响

HE染色可见AMI组小鼠心肌组织肌纤维结构排列紊乱,大量炎症细胞浸润。与AMI组相比,替格瑞洛治疗组、替格瑞洛预处理组和替格瑞洛预处理+治疗组小鼠心肌组织炎症细胞减少,结构排列更整齐,其中替格瑞洛预处理+治疗组变化最明显,见图1A~E。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色结果显示,与sham组相比,AMI组小鼠心肌组织梗死面积明显增大;与AMI组相比,替格瑞洛治疗组、替格瑞洛预处理组和替格瑞洛预处理+治疗组小鼠心肌组织梗死面积均出现不同程度的减小,其中,替格瑞洛预处理组和替格瑞洛预处理+治疗组小鼠梗死面积减少更明显,见图1F。

A:sham组小鼠心肌组织HE染色(200×);B:AMI组小鼠心肌组织HE染色(200×);C:替格瑞洛治疗组小鼠心肌组织HE染色(200×);D:替格瑞洛预处理组小鼠心肌组织HE染色(200×);E组:替格瑞洛预处理+治疗组小鼠心肌组织染色(200×);F:小鼠心肌组织TTC染色。

2.3 替格瑞洛对AMI小鼠模型心肌组织炎症因子的影响

ELISA检测结果显示,与sham组相比,AMI组小鼠心肌组织炎症因子IL-18、IL-1β和TNF-α表达水平明显升高(P<0.01)。与AMI组比较,替格瑞洛治疗组、替格瑞洛预处理组和替格瑞洛预处理+治疗组上述指标表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),其中,替格瑞洛预处理+治疗组变化最明显,替格瑞洛预处理组次之,见图2。

A:IL-18水平;B:IL-1β水平;C:TNF-α水平;a:P<0.01,与sham组相比;b:P<0.05,c:P<0.01,与AMI组相比;d:P<0.05,e:P<0.01,与替格瑞洛治疗组相比;f:P<0.01,与替格瑞洛预处理组相比。

2.4 替格瑞洛对AMI小鼠模型心肌组织巨噬细胞的影响

免疫荧光结果显示,与sham组相比,AMI组小鼠心肌组织CD68阳性细胞数目明显增多。与AMI组相比,替格瑞洛治疗组、替格瑞洛预处理组和替格瑞洛预处理+治疗组CD68阳性细胞数目明显减少,其中替格瑞洛预处理+治疗组变化最明显,见图3。

图3 各组小鼠心肌组织CD68表达情况(IF,400×)

2.5 替格瑞洛对AMI小鼠模型心肌组织NLRP3炎症小体通路相关蛋白的影响

Western blot结果显示,与sham组相比,AMI组小鼠心肌组织NLRP3、cleaved caspase-1、pro-IL-1β和cleaved IL-1β表达水平明显增加(P<0.01)。与AMI组相比,替格瑞洛治疗组、替格瑞洛预处理组和替格瑞洛预处理+治疗组上述蛋白表达水平均呈不同程度降低(P<0.05或P<0.01),其中替格瑞洛预处理+治疗组变化最明显,替格瑞洛预处理组次之,见图4。

A:蛋白条带图;B:蛋白相对表达水平柱状图;a:P<0.01,与sham组相比;b:P<0.05,c:P<0.01,与AMI组相比;d:P<0.01,与替格瑞洛治疗组相比;e:P<0.01,与替格瑞洛预处理组相比。

2.6 替格瑞洛对AMI小鼠模型心脏组织自噬的影响

免疫荧光结果显示,与sham组相比,AMI组p62阳性细胞数目明显增多;与AMI组相比,替格瑞洛治疗组、替格瑞洛预处理组和替格瑞洛预处理+治疗组p62阳性细胞数目明显减少,其中替格瑞洛预处理+治疗组变化最明显,见图5。

图5 各组小鼠心肌组织p62表达情况(IF,400×)

Western blot检测结果显示,与sham组相比,AMI组p62表达水平明显增加(P<0.01),而LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表达水平有所增加,差异均无统计学意义(P>0.05);与AMI组相比,替格瑞洛治疗组、替格瑞洛预处理组和替格瑞洛预处理+治疗组LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表达水平均明显增加(P<0.01),而p62表达水平明显降低(P<0.01),其中替格瑞洛预处理+治疗组变化最明显,替格瑞洛预处理组次之,见图6。

A:蛋白条带图;B:蛋白相对表达水平柱状图;a:P<0.01,与sham组相比;b:P<0.01,与AMI组相比;c:P<0.05,d:P<0.01,与替格瑞洛治疗组相比;e:P<0.05,f:P<0.01,与替格瑞洛预处理组相比。

电镜结果显示,与AMI组比较,替格瑞洛治疗组、替格瑞洛预处理组和替格瑞洛预处理+治疗组小鼠心肌细胞自噬小体数量均呈不同程度的增加,见图7。

图7 各组小鼠心肌细胞自噬小体数量的变化情况(电镜,40 000×)

3 讨 论

AMI是冠心病常见的急重病,严重危害患者生命健康[9]。P2Y12受体拮抗剂替格瑞洛是AMI中抗血栓治疗的一线用药[10]。CHEN等[11]发现,替格瑞洛通过抑制NLRP3炎症小体途径而不依赖P2Y12受体在糖尿病心肌病小鼠中发挥抗炎作用。NLRP3炎症小体途径是机体先天免疫系统的重要组成部分,当该途径被激活时,NLRP3与其他蛋白相互作用精细调节caspase-1激活,而活化的caspase-1(cleaved caspase-1)通过剪切pro-IL-1β和pro-IL-18,产生具有致炎活性的IL-1β和IL-18,进而激活其他免疫细胞,诱导更多的趋化因子和炎症因子的合成,放大炎症反应[12]。自噬是体内重要的细胞内过程,用于回收和去除受损蛋白质和细胞器,以及破坏细胞内病原体[13]。研究表明,自噬可通过多种机制调节NLRP3小体途径的激活,是炎症小体的主要调节因子[14-16]。因此,自噬功能障碍可导致炎症小体过度激活,包括NLRP3。研究证实,心肌细胞炎症反应和细胞自噬在AMI发病机制中占重要地位[17-20]。

为了探究替格瑞洛在AMI中潜在的作用,本研究采用结扎左前降支冠状动脉的方法建立AMI小鼠模型,分别在造模前后不同时间给予替格瑞洛治疗。结果发现,替格瑞洛可保护心肌免受损伤,使LVIDd、LVIDs明显降低,FS、EF明显增加,血清cTnⅠ水平降低,CK-MB和LDH活性降低,心脏的脏器系数(心脏质量/体重)降低,心肌组织炎症细胞浸润明显减少,心脏梗死面积明显减小。同时,本研究发现替格瑞洛可明显降低心肌组织中促炎细胞因子IL-18、IL-1β和TNF-α表达,抑制CD68蛋白(巨噬细胞蛋白标志物)表达,表明替格瑞洛可能通过抑制促炎细胞因子释放和巨噬细胞浸润在AMI中发挥抗炎作用。进一步对NLRP3途径相关蛋白进行检测发现,替格瑞洛可明显降低NLRP3、cleaved caspase-1、pro-IL-1β和cleaved IL-1β表达,表明替格瑞洛可通过抑制NLRP3炎症小体途径的激活进而抑制心肌组织炎症反应。同时,为探究替格瑞洛是否干预AMI模型中心肌细胞自噬水平,本研究通过免疫荧光实验检测发现AMI模型小鼠心肌组织中有大量的p62分布,而应用替格瑞洛干预后发现,替格瑞洛抑制p62在心肌组织的分布,同时Western blot定量结果也显示了替格瑞洛可促进LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1表达,抑制p62表达。最后,通过透射电镜观察发现替格瑞洛干预后自噬小体明显增多,结果均表明替格瑞洛可通过促进AMI模型心肌细胞自噬而发挥保护作用。此外,在上述全部实验结果中,替格瑞洛预处理+治疗组干预AMI效果最好,替格瑞洛预处理组次之,表明替格瑞洛对AMI的防治意义重大。

综上所述,本研究初步验证了替格瑞洛具有抗炎、促进自噬、改善梗死心脏功能和形态的作用,为AMI疾病的预防和治疗提供了理论基础和治疗见解。本研究的不足之处在于:(1)未进行细胞水平实验探究替格瑞洛作用于心肌细胞的具体分子机制;(2)未设立NLRP3激动剂组及自噬抑制剂组进行挽救实验,进一步探究替格瑞洛的防治效果;(3)未阐明NLRP3炎症小体途径和细胞自噬之间的crosstalk机制。今后可在此基础上进一步深入实验,以探索和阐明替格瑞洛对AMI的保护作用机制。

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