董泽樟， 薛舒心， 曹井国

(天津科技大学化工与材料学院， 天津300457)

水体中氮、磷污染的加剧容易引起藻类暴发，使水源地水质恶化。过量的藻类会影响水厂传统净水工艺，导致消毒副产物增加，同时有害藻类产生的代谢产物(如藻毒素)会释放到水体中，严重影响水质安全。针对原水藻类增多，研发新型除藻技术十分必要。

金属有机骨架(metal organic framework，MOF)是由有机配体和无机金属离子通过配位键自组装形成的具有分子内孔隙的有机-无机杂化材料，具有高比表面积、高孔隙率和高密度的活性位等优点，在抑菌、环境修复等领域展现出巨大潜力[1]。壳聚糖是由甲壳素脱乙酰后得到的产物，是一种天然无毒的高分子化合物，分子链上存在着大量的氨基和羟基[2]，通过化学改性[3]或负载活性物质[4]，在除藻领域具有广阔的应用前景。

本文选用壳聚糖纤维和锌基MOF为原材料，通过吸附的方法，制备得到CS-MOF纤维，研究其对铜绿微囊藻生长、细胞结构、光合系统、抗氧化系统以及藻毒素的影响，进而揭示CS-MOF纤维对铜绿微囊藻的抑制效果与机理，以期为净水厂除藻问题提供新的解决思路。

1 材料与方法

1.1 材料

铜绿微囊藻(FACHB-905)，购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。培养条件：温度25 ℃，湿度60%，光照强度2 400 lx，光暗时间比12 h∶12 h，每天摇动3～4次。

壳聚糖纤维购自中盛生物工程有限公司，锌基MOF材料参照文献[5]方法制备。取2.5 g MOF加入1 L乙醇溶液，超声溶解30 min后，投加50 g壳聚糖纤维，室温下搅拌5 min，随后静置12 h，接着继续搅拌5 min，取出后自然晾干得到CS-MOF纤维。

1.2 方法

实验设置3个处理组：分别将0.2、0.4和0.6 g CS-MOF纤维加入到1 000 mL铜绿微囊藻液中，空白组不添加其他物质，每组重复3次。将初始藻液OD680值调定为1，藻细胞密度约为8×106mL-1。实验期间，每72 h测定一次各组藻液的OD680值。

1.3 细胞结构

参照赵红艳等[6]的方法，拍摄扫描电镜图；参照Heath等[7]的方法，采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定丙二醛(MDA)的含量。

1.4 光合系统

参照Wang等[8]的方法，采用95%乙醇提取测定藻细胞中叶绿素a和类胡萝卜素含量；参照Padgett等[9]的方法，采用低温冻融法提取测定藻胆蛋白含量。

1.5 抗氧化酶活性

超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性按照试剂盒说明进行测定(购自北京索莱宝科技有限公司)。

1.6 藻毒素测定

参照国标GTB 20466—2006[10]和Zheng等[11]方法，采用高效液相色谱测定细胞内外藻毒素含量。

1.7 统计分析

数据处理方法参见文献[12]。

2 结果与讨论

2.1 对铜绿微囊藻生长的影响

铜绿微囊藻的细胞密度与680 nm处的吸光度(OD680)呈正相关[13]，本文测定藻液的OD680作为生物量参数，反映藻类的生长情况。CS-MOF纤维对铜绿微囊藻的生长影响如图1所示。

图1 CS-MOF纤维对铜绿微囊藻生长的影响Figure 1 Effect of CS-MOF fiber on the growth of Microcystis aeruginosa

由图1可知：试验初始各组藻液的OD680值为1.00左右，至第12天时，空白组的藻液OD680值为1.95；CS-MOF纤维投加量为0.2、0.4和0.6 g/L的处理组中，藻液OD680值分别为0.45、0.39和0.28，抑制率分别为76.9%、80.0%和85.6%。铜绿微囊藻的生长受到明显的抑制，其抑制效果与CS-MOF纤维的投加量和处理时间有关。

2.2 对铜绿微囊藻细胞结构的影响

在试验进行到第12天时，拍摄处理组与空白组藻细胞的扫描电镜图，结果如图2所示。

(a)0 g/L；(b)0.2 g/L；(c)0.4 g/L；(d)0.6 g/L。图2 不同投加量CS-MOF纤维处理后的铜绿微囊藻SEM图像Figure 2 SEM images of Microcystis aeruginosa treated by CS-MOF fiber with different dosages

从图2(a)可知，试验至第12天时，空白组的藻细胞表面光滑呈球状，且独立分布，生长状况良好。在图2(b)(投加0.2 g/L的处理组)中，藻细胞之间出现了互相粘连的情况，细胞壁出现明显褶皱和破裂；此外，图中出现许多条状物，这是由于细胞破裂胞内的类囊体大量释放所形成。从图2(c)和(d)可知：在CS-MOF纤维投加量为0.4 g/L和0.6 g/L的处理组中，已经无法观察到正常生长的藻细胞，其形态均发生显著变化，伴随着藻细胞的裂解，胞内的类囊体大量释放；在0.6 g/L的处理组中，由于损伤作用更强，类囊体出现断裂，CS-MOF纤维对铜绿微囊藻造成损伤，导致细胞破裂死亡。

由图3可知，随着CS-MOF纤维投加量的增加与处理时间的延长，处理组中MDA含量显著增高，而空白组中的MDA含量保持相对稳定。试验至第12天时，空白组中MDA含量为0.045 5 nmol/L，3个处理组中，MDA含量分别为0.109、0.124和0.135 nmol/L，分别是对照组的2.40、2.73和2.97倍。结果表明，藻细胞受到了严重的氧化损伤作用，细胞膜出现裂解。

图3 CS-MOF纤维对铜绿微囊藻丙二醛含量的影响Figure 3 Effect of CS-MOF fiber on MDA content of Microcystis aeruginosa

2.3 对铜绿微囊藻光合系统的影响

由图4可知，当试验进行到第12天时，投加0.2、0.4和0.6 g CS-MOF纤维的处理组，叶绿素a含量相较对照组分别下降了80.7%、85.4%和87.6%，类胡萝卜素分别降低了84.8%、88.0%和88.8%。CS-MOF纤维能够有效抑制铜绿微囊藻的叶绿素a和类胡萝卜素，破坏光合作用，导致能量不能被有效地捕获吸收，阻碍藻细胞生长。此外，类胡萝卜素具有重要的光损伤防护功能，其含量降低会造成叶绿素上多余的能量转移至氧分子产生单氧原子(O·)[14]，形成更多的活性氧(ROS)，加剧氧化损伤作用。

(a)叶绿素a；(b)类胡萝卜素。图4 CS-MOF纤维对铜绿微囊藻光合作用的影响Figure 4 Effect of CS-MOF fiber on photosynthesis of Microcystis aeruginosa

由图5可知，与空白组相比，第12天时，投加0.2、0.4和0.6 g/L CS-MOF纤维的处理组，对藻蓝蛋白抑制率分别为97.2%、99.7%和99.7%，对别藻蓝蛋白的抑制率分别为98.6%、98.9%和99.3%，对藻红蛋白的抑制率分别为94.4%、96.8%和97.0%。

(a)藻蓝蛋白；(b)别藻蓝蛋白；(c)藻红蛋白。图5 CS-MOF纤维对铜绿微囊藻藻胆蛋白的影响Figure 5 Effect of CS-MOF fiber on phycocyanin of Microcystis aeruginosa

从上述结果可知，CS-MOF纤维可以显著抑制并破坏藻细胞的光合系统，阻碍能量的吸收与传递。藻胆蛋白的变化趋势与叶绿素a、类胡萝卜素的变化趋势大致相同，但CS-MOF纤维对藻胆蛋白的抑制率显著高于叶绿素a和类胡萝卜素的抑制率。李建宏等[15]、周长芳等[16]在对重金属元素抑藻研究过程中发现，藻胆蛋白是重金属元素攻击的重要靶点之一。此外，Wu等[17]在化感物质抑藻过程中也发现，叶绿素比藻胆蛋白有更高的耐受性。研究表明藻胆蛋白可能是CS-MOF纤维对铜绿微囊藻抑制作用的一个敏感作用位点。

2.4 对铜绿微囊藻抗氧化酶活性的影响

在试验过程中SOD活性呈下降趋势，至第12天时空白组中SOD活性为0.007 37 U/104cell，而在投加0.2、0.4和0.6 g/L CS-MOF纤维的处理组中，SOD活性分别为0.002 29、0.001 56和0.001 34 U/104cell，活性分别降低了68.9%、78.8%和81.8%，见图6(a)。由图6(b)可知，试验前期CAT活性略有增高，这可能是藻细胞为了对抗氧化损伤而作出的应激反应，但总体来看，CAT活性在正常水平内浮动，并无明显的趋势变化。

(a)SOD；(b)CAT。图6 CS-MOF纤维对铜绿微囊藻酶活性的影响Figure 6 Effect of CS-MOF fiber on the content of enzymatic activity in Microcystis aeruginosa

以往的研究发现，外源物质可能会诱导产生活性氧，引起氧化应激，而藻细胞自身的抗氧化系统也会进行相关调整来应对胁迫。其中SOD起着将超氧自由基转化成H2O2的重要作用，而CAT主要负责将H2O2进一步转换成O2，通过协同作用来减轻ROS的损伤作用[18]。研究结果表明：实验期间处理组中SOD活性持续下降，导致将超氧自由基转化成H2O2的能力不足，进而未能激发CAT活性，这也说明了CAT活性为何没有明显变化；而SOD活性长时间低于正常细胞水平，表明细胞内过量的ROS不能被有效清除，导致藻细胞受到氧化损伤作用，先前对MDA含量的测定结果很好地证明了这一观点。综上所述，CS-MOF纤维能够有效地破坏藻细胞的抗氧化酶系统，通过抑制SOD活性抑制藻细胞生长，而对CAT活性并无明显影响。

2.5 对铜绿微囊藻藻毒素的影响

由图7可知，在添加CS-MOF纤维的处理组中，细胞内藻毒素下降明显。至第12天时，CS-MOF纤维投加量为0.4 g/L和0.6 g/L的处理组中，细胞内藻毒素的含量已经低于检测下限，抑制率几乎达到100%；而在0.2 g/L的处理组中，抑制率也达到97%。

图7 CS-MOF纤维对铜绿微囊藻中藻毒素的影响Figure 7 Effect of CS-MOF fiber on microcystins in Microcystis aeruginosa

从胞外藻毒素变化趋势可知：第3天时，处理组胞外藻毒素含量急剧增高，这是因为藻细胞破裂，导致胞内藻毒素释放。6～12 d时，处理组胞外藻毒素的含量逐渐趋于稳定并出现下降，在0.6 g/L的处理组中，藻毒素下降趋势明显。连丽丽等[19]在磁性吸附剂上成功修饰了功能化壳聚糖分子，实验结果表明，吸附剂对MC-LR具有较好的吸附能力。此外，通过溶剂热法制备的金属有机框架材料MIL-101(Fe)对微囊藻毒素也表现出良好的吸附性能[20]。

试验期间，处理组的总藻毒素含量呈下降趋势，至第12天时，相较空白组，3个处理组总藻毒素的含量分别降低了81.1%、85.4%和90.8%，细胞数量的减少与CS-MOF纤维的吸附作用是主要原因。关于如何提高CS-MOF纤维对藻毒素的吸附效果，仍有待进一步研究。

3 结论

研究表明，CS-MOF纤维能够有效抑制铜绿微囊藻的生长。当CS-MOF纤维投加量为0.6 g/L时，经12 d处理，对铜绿微囊藻的生长抑制率可达85.6%。CS-MOF纤维对藻细胞造成胁迫损伤，使其结构形态发生明显改变。CS-MOF纤维对铜绿微囊藻的光合系统具有显著的抑制破坏作用，其中藻胆蛋白是抑制作用的敏感作用位点。CS-MOF纤维可以引起藻细胞抗氧化系统失衡，抑制铜绿微囊藻的SOD活性，而对CAT活性并无明显影响。