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内生多黏类芽孢杆菌对人参不同部位农药残留降解与皂苷单体累积的影响

2022-10-20郜玉钢

生物学杂志 2022年5期
关键词:皂苷芽孢人参

郜玉钢, 高 飞, 田 颖, 王 茜, 臧 埔

(1.吉林农业大学中药材学院,长春130118; 2.吉林省人参工程技术研究中心,长春130118)

药材人参为五加科植物人参panaxginsengC.A. Mey的干燥根和根茎,具有抗疲劳、抗肿瘤、抗抑郁、改善记忆力、延缓衰老、增加免疫力等多种生物活性[1-9]。其中人参皂苷是评价人参及其产品质量的重要指标,因此对如何提高人参皂苷含量的研究已势在必行。人参属多年生药用植物,导致人参病虫害较其他药用植物更易发生,人参病害防治依然以化学农药为主,由于人参种植中农药过量使用,常导致人参农药残留[10]。农药残留在人参及土壤中残存时间长且代谢较为迟缓,因此如何降解甚至去除人参中农药残留成为研究热点。微生物降解法,目前已成为解决农药残留的问题最广泛的方法[11-13],其中内生菌更是现阶段的重要研究目标[14-15]。对人参内生菌的研究主要集中在抑菌活性[16-17]、抗肿瘤活性[18]和转化皂苷[19]等方面,少数集中于农药残留的降解方面。因此,本研究通过多黏类芽孢杆菌处理人参,对处理前后人参根中不同部位的人参皂苷单体、农药残留含量进行对比分析,探究多黏类芽孢杆菌对各部位9种人参皂苷单体累积和8种农药残留降解的影响,以期为人参及其各部位生物资源的优质高效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

4年生高农残人参(PanaxginsengC.A.Mey)的茎叶(来自农药残留试验田)。8种标准品分别为六氯苯标准品[GBW(E)081914]、五氯硝基苯标准品(1501)、七氯标准品[GBW(E)081455]、艾氏剂标准品[GBW(E)081457]、氧化氯丹标准品(SB-05-380-2017)、环氧七氯标准品[GBW(E)08145]、反式氯丹标准品(SB-05-064-2008)、顺式氯丹标准品(SB-05-065-2008),均购自上海源叶生物科技有限公司,纯度均≥98%;乙腈(色谱纯,美国Fisher公司,批号:180115);正己烷(色谱纯,美国Fisher公司,批号:1674129),其他试剂均为市售分析纯;水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈饮料科技有限公司,批号:200301);CHA-S型气浴往返恒温振荡培养箱(江苏省金坛市大地自动化仪器厂);200 Pro型多功能酶标仪(上海迪奥生物科技有限公司)。LC-2010A高效液相色谱仪(配有LC-2010A型液相色谱泵、LC-2010A型自动进样器、CLASS-VP色谱工作站);GC-14C气相色谱仪(配有电子捕捉检测器、日本岛津公司)。AUY220电子分析天平(日本岛津公司);KQ-250DV超声波清洗器(昆山舒美超声仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 混合标准品溶液配制

精密称取六氯苯、五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、氧化氯丹、环氧七氯、反式氯丹、顺式氯丹对照品适量,置于容量瓶中,加入正己烷溶液制成每1 mL含六氯苯5 μg、五氯硝基苯10 μg、七氯10 μg、艾氏剂10 μg、氧化氯丹10 μg、环氧七氯10 μg、反式氯丹10 μg、顺式氯丹10 μg的混合溶液,摇匀。精密量取上述混合溶液加正己烷配置成质量浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.15、0.2和1 μg/mL,经0.22 μm滤膜过滤,备用。

1.2.2 多黏类芽孢杆菌的培养

将适量生长良好的多黏类芽孢杆菌接入装有50 mL PDB培养基的容量为250 mL的锥形瓶中,120 r/min、28 ℃往复摇床培养48 h,收集菌体,用酶标仪测定菌液OD600值,调到0.5备用。

1.2.3 多黏类芽孢杆菌对田间栽培人参处理

实验设置在吉林省靖宇县内农药残留试验田进行,采收一批4年生高农残人参,将部分人参移栽进行田间实验。设置6个小区,每个小区1 m2,1~3小区人参根部喷施多黏类芽孢杆菌,含量为108CFU/mL,喷施量为150 mL,用喷雾器喷施根部及土壤,保证分布均匀,4~6小区设置空白对照小区。于秋季采收样品,每小区采集30株人参。

1.2.4 人参样品处理

将降解前后的新鲜人参净制,表皮水分近干,将其分割为木质部、韧皮部、芦头、须根和支根等5个部位,阴干后打粉备用。

1.2.5 样品农药残留的制备与测定

分别精密称取干燥后的人参各部位粉末1 g置于100 mL三角烧瓶中,加入丙酮-石油醚(体积比1∶4)20 mL,20 min超声提取,静止,将上清液过滤到三角瓶中,再加入丙酮-石油醚(体积比1∶4)15 mL,再提取两次,每次10 min,合并滤液后将滤液于40 ℃水浴下浓缩,挥干,用石油醚将残渣定容至5 mL,加入1 mL浓硫酸(10%),振摇1 min,离心10 min(3 000 r/min),取上清液,于40 ℃水浴浓缩至近干,加入2 mL正己烷溶解,经0.22 μm有机滤膜过滤备用。气相色谱测定条件参考《中国药典》的GC方法。色谱柱: OV-1701石英毛细柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);检测器:ECD;检测器温度:300 ℃;进样口:230 ℃。程序升温:初始温度60 ℃,保持0.3 min,以每分钟60 ℃升至170 ℃,再以每分钟10 ℃升至220 ℃,保持10 min,再以每分钟1 ℃升至240 ℃,再以每分钟15 ℃升至280 ℃,保持5 min。载气:高纯氮气(纯度>99.999%);流速1.0 mL/min,采用分流进样,进样量1.0 μL;分流比为3∶1。

1.2.6 样品的皂苷制备与测定

分别精密称取已干燥的人参各部位粉末0.50 g,分别置于10 mL离心管中,加入5 mL色谱级甲醇,密封,超声1 h后静置、过夜,次日再进行超声1 h后,于5 000 r/min下离心15 min,取上清液过0.22 μm滤膜,置于液相小瓶中备用。HPLC测定皂苷含量,色谱条件参照本实验室建立的同时测定9种人参皂苷含量的方法[20]。乙腈(A)-水(B)为流动相,柱温为35 ℃,检测波长为 203 nm,流速为 1.0 mL/min,进样量为20 μL。梯度洗脱:0~24 min,82%~78% B; 24~26 min,78%~74% B; 26~30 min,74%~68% B; 30~50 min,68%~66.5% B; 50~55 min,66.5%~62% B; 55~65 min,62%~62% B。

1.2.7 统计分析

1.2.8 降解率计算公式

式中:A1为对照样品残留量;A2为经处理后样品残留量。

2 结果与分析

2.1 多黏类芽孢杆菌对人参不同部位农药残留含量的影响

2.1.1 建立8种农药残留标准曲线线性关系

由图1可见8种农药均分离良好,1~8分别为六氯苯、五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、氧化氯丹、环氧七氯、反式氯丹、顺式氯丹。以标准品中的农药质量(Y)和相应峰面积的积分值(X)作图,计算得到8个线性回归方程,如表1所示,这8种农药在0.02~1 μg/mL范围内呈良好的线性关系(r≥0.990 1)。

图1 8种农药混合标品气相色谱图Figure 1 Standard chromatogram of 8 pesticide residues with GC

2.1.2 8种农药残留标准曲线精密度

精密吸取混合标准品溶液1 μL,已定色谱条件下重复进样6次,记录峰面积,六氯苯、五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、氧化氯丹、环氧七氯、反式氯丹和顺式氯丹的相对标准偏差(RSD)分别为2.14%、1.95%、1.88%、2.13%、1.46%、1.57%、1.93%和2.07%,均符合农药残留分析标准。

2.1.3 8种农药残留标准曲线定量限与检出限

在已定的色谱条件下,信噪比为3时测得农药六氯苯、五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、氧化氯丹、环氧七氯、反式氯丹和顺式氯丹的检测线(LOD)均在1.6×10-3~5.1×10-3μg/g;信噪比为10时,测得农药六氯苯、五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、氧化氯丹、环氧七氯、反式氯丹和顺式氯丹的定量限(LOQ)均达到0.02 μg/g。均基本达到人参农药残留检测技术的要求。

2.1.4 8种农药残留标准曲线稳定性检验

精密称取供试品溶液1 μL,分别于配制后0、4、8、12和24 h在已定色谱条件测定,记录峰面积,六氯苯、五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、氧化氯丹、环氧七氯、反式氯丹和顺式氯丹的RSD分别为0.37%、0.51%、0.46%、0.55%、0.69%、0.44%、0.53%和0.69%,表明样品在24 h内稳定。

2.1.5 8种农药残留标准曲线重复性检验

精密称取6份同一批人参粉末,按1.2.5含量测定方法处理,六氯苯、五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、氧化氯丹、环氧七氯、反式氯丹和顺式氯丹的RSD分别为2.16%、1.87%、1.43%、1.55%、2.38%、1.97%、2.03%和1.95%,说明该实验方法的重复性良好。

2.1.6 8种农药残留标准曲线加样回收率检验

称取人参粉末1 g,共6份,分别加入1 μg/g的标样,静置1 h,进样1 μL,相同处理方法、制备条件及色谱条件测定六氯苯、五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、氧化氯丹、环氧七氯、反式氯丹和顺式氯丹平均回收率分别为96.98%、97.39%、99.17%、101.13%、97.69%、98.74%、101.37%和96.55%。RSD分别为1.23%、3.47%、1.37%、1.84%、1.69%、2.77%、3.18%和2.17%,本实验方法符合农药残留的分析标准。

2.1.7 多黏类芽孢杆菌处理前后人参不同部位农药残留的GC色谱峰

人参各个部位处理前后农药残留量如图2所示,人参各个部位样品中色谱峰保留时间准确且分离良好,测定结果可靠。本批次样品中仅检测到五氯硝基苯的农药残留,其他7种农药残留均未检测到。

图2 多黏类芽孢杆菌对人参不同部位的农药残留降解的影响色谱图Figure 2 Chromatogram of effect of Bacillus polymyxa on the degradation of pesticide residues in different parts of ginseng

2.1.8 多黏类芽孢杆菌对人参不同部位农药残留的降解

高残留人参各部位降解前后五氯硝基苯含量如表2所示,相同处理条件下,各部位之间农药残留量均具有显著性差异(P<0.05)。处理前人参各部位农药残留量由大到小排列依次为芦头、须根、支根、韧皮部、木质部,农药残留量为0.510 7、0.278 6、0.185 2、0.139 5和0.085 1 mg/kg。自然对照处理组中高残人参各部位农药残留量由大到小排列依次为芦头、须根、支根、韧皮部、木质部,农药残留量分别为0.459 8、0.257 4、0.160 5、0.128 3和0.078 5 mg/kg,与处理前分布规律保持一致。多黏类芽孢杆菌处理组,高残人参各部位中农药残留量发生改变,含量由大到小排列依次为韧皮部、须根、芦头、支根、木质部,残留量分别为0.093 9、0.083 8、0.065 1、0.057 4和0.038 9 mg/kg。均符合药典残留量规定要求。高残人参各部位降解率由表2所示,同一部位,与处理前相对比,多黏类芽孢杆菌处理组对高残人参各部位的农药残留均有不同的降解效果,具有显著性差异(P<0.05),降解率由大到小依次为芦头87.25%、须根69.87%、支根69.02%、木质部54.28%、韧皮部32.69%;对照组各部位降解率仅为7.58%~13.33%。

2.2 多黏类芽孢杆菌对人参不同部位的人参皂苷含量的影响

2.2.1 多黏类芽孢杆菌处理前后人参不同部位人参皂苷含量的HPLC色谱峰

如图3可知,9种人参皂苷单体混合标准品均分离良好,依次分别为Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3和Rd。高残留人参各个部位样品中人参皂苷单体色谱峰保留时间准确且分离良好,测定结果可靠。

1-9分别为Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3和Rd。图3 9种人参皂苷单体混合标品和高残留人参样品液相色谱图Figure 3 Liquid chromatogram of 9 ginsenoside monomer mixed standard products and high-residual ginseng samples

2.2.2 多黏类芽孢杆菌对人参不同部位的人参皂苷累积的影响

由表3可知,相同处理下人参各部位9种人参皂苷加合值的含量有所不同,处理前人参各部位9种人参皂苷加合值的含量由大到小依次为须根1.304 0%、芦头1.080 4%、支根0.119 8%、韧皮部0.791 5%、木质部0.694 4%,各部位间具有显著性差异(P<0.05)。多黏类芽孢杆菌处理组中人参皂苷加合值的含量由大到小排列依次为须根2.069 2%、芦头1.666 0%、支根1.335 4%、韧皮部0.954 6%、木质部0.224 7%,各部位间具有显著性差异(P<0.05)。芦头中Rg1、Re、Rf、Rg2、Rc、Rb2、Rb3皂苷含量较高,韧皮部中Rg1、Rf皂苷含量较高,须根中Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd皂苷含量较高,支根中9种皂苷含量较为均衡,则木质部中各个人参皂苷单体含量、种类最为稀少。在同一人参部位,多黏类芽孢杆菌处理组相比于处理前、对照组,除人参皂苷单体Rc含量有所减少,其他8种人参皂苷单体及加合值均有不同程度的累积。相比自然对照组,各个部位的9种人参皂苷加合值的累积含量不同,9种人参皂苷加合值累积量提高率依次为须根21.34%、芦头12.00%、支根9.03%、韧皮部8.60%以及木质部8.18%(P<0.05)。

3 讨论

人参内生多黏类芽孢杆菌是美国FDA规定可直接用于食品的益生菌,在生物防治上具有很好的应用[21],研究是在人参内生多黏类芽孢杆菌对农田人参农药残留降解及人参皂苷累积有良好作用的基础上进一步深入研究[22]。人参各部位中人参皂苷Rb1含量几乎达到最高,与冯素香等[23]研究报道相一致。逄世峰等[24]报道,人参须根中Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd是主要皂苷,人参芦头中Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2是主要皂苷,芦头中Rg1和Re含量基本相同,这与本研究结果大致相同。但对人参不同部位农药残留分布以及利用人参内生多黏类芽孢杆菌探究其对人参不同部位的农药残留及人参皂苷影响研究尚未见报道。研究首次报道人参内生多黏类芽孢杆菌对高农残人参不同部位8种农药残留动态降解和9种皂苷动态累积促进作用,对有效提高人参产品的质量和使用的安全性,对人参资源不同部位合理利用均具有重要意义。

4 结论

高残留人参各部位农药残留和人参皂苷单体含量不同。人参各部位农药残留量由大到小排列依次为芦头、须根、支根、韧皮部、木质部。人参各部位9种人参皂苷加合值的含量由大到小依次为须根、芦头、支根、韧皮部、木质部。多黏类芽孢杆菌对高残人参中各部位农药残留降解和人参皂苷单体累积作用不同,多黏类芽孢杆菌对人参5个部位农残降解率由大到小依次为芦头>须根>支根>木质部>韧皮部。多黏类芽孢杆菌对人参各部位的9种人参皂苷加合值的含量累积效果由大到小依次为须根>芦头>支根>韧皮部>木质部。

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