杨 宁， 邓 江， 王怡恺， 常 莎， 高 宁， 王文俊， 党双锁， 石娟娟

1 陕西中医药大学附属医院 肿瘤医院， 陕西 咸阳 712000；2 西安交通大学第二附属医院 感染科， 西安 710004

蜂胶性甘平，具有清热解毒、补中润燥、止痛之功效，是日常保肝养生的保健食品之一。咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)是蜂胶提取物黄酮类中最具活力的单体成分之一，目前已被证明其具有较强的抗氧化、抗炎等多种生物活性[1-2]。本课题组前期动物实验[3-4]结果发现，CAPE具有明显的保护肝损伤及抗肝纤维化作用，但其作用机制尚待进一步阐明。本研究通过体外培养大鼠肝星状细胞(HSC)-T6，初步探讨CAPE体外抑制HSC的作用及可能的作用机制，以期为CAPE治疗肝纤维化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 大鼠HSC-T6购自南京凯基生物公司，HSC-T6细胞常规培养于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/链霉素双抗的DMEM高糖溶液中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.1.2 药物与试剂 CAPE纯度≥97% (HPLC)购自美国Sigma公司(批号：24278341)。真核表达重组质粒GFP-LC3由西安交通大学第二附属医院科研实验平台赠予。胎牛血清、DMEM高糖培养液、胰蛋白酶、青霉素/链霉素双抗溶液均购自美国Hyclone公司；去内毒素质粒提取试剂盒、E.Z.N.A®Total RNA试剂盒均购自美国Omega公司；反转录试剂盒PrimeScript®RT Master Mix、荧光定量PCR试剂盒SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ均购自日本TAKARA公司；LipofectamineTM2000转染试剂、ECL发光试剂盒均购自美国Thermo Fisher公司；LC3 Ⅰ/Ⅱ、p-mTOR、AKT、p-AKT、Atg7均购自美国Cell Signaling公司，Beclin1购自美国Proteintech公司，β-actin购自SANTA CRUZ公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养、分组及MTT实验 从液氮中取出保种冻存的HSC-T6细胞，常规复苏、培养细胞。取对数生长期的HSC-T6细胞，以每孔6×105细胞接种于6孔板中，置于CO2培养箱中静置培养。根据前期MTT实验结果[4]，其显示CAPE抑制HSC-T6细胞增殖，并呈剂量依赖性，因此最终选择3种不同浓度的CAPE(5、10、15 μmol/L)作用于HSC-T6细胞继续培养24 h，以不加CAPE的空白组为对照组。

1.2.2 透射电子显微镜检测 CAPE作用于HSC-T6细胞24 h后，(1)取材：取1×106个细胞置于2.5%戊二醛固定液中4 ℃固定2 h；(2)固定：用1%四氧化锇固定液于4 ℃固定2 h，磷酸缓冲液浸洗；(3)脱水：室温下乙醇梯度脱水，即30%乙醇10 min，50%乙醇10 min，70%乙醇10 min，70%的乙醇醋酸双氧铀块染色2 h或者过夜，90%乙醇10 min×2次，100%乙醇10 min×3次；(4)浸透：于环氧丙烷中置换10 min，环氧树脂(Epon812)浸透；(5)包埋：吸取混合包埋剂滴于胶囊模块孔的底部并注满，放于60 ℃烤箱烘烤2 h；(6)修块：显微镜下修整并去除表面包埋剂；(7)切片：制作半超薄切片1～2 μm，然后进行美兰染色，于超薄切片机下切片50～70 nm；(8)电子染色：柠檬酸铅、醋酸铀染色后，透射式电子显微镜下观察、拍照。

1.2.3 细胞免疫荧光实验 取对数生长期的HSC-T6细胞，以1×104个细胞/孔接种于30 mm细胞培养皿中，同时将无菌盖玻片放至其中使细胞开始爬片，细胞处于对数生长期时，CAPE作用于HSC-T6细胞24 h；4%多聚甲醛固定；TBST，20 min；5% BSA封闭1 h；一抗4 ℃过夜；二抗FITC，室温避光孵育1 h；PBS洗涤10 min×4次；DAPI，2 min；取出玻片，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片；荧光显微镜高倍视野下观察、拍照；采用Image J软件进行分析。

1.2.4 GFP-LC3转染 根据去内毒素质粒提取试剂盒步骤进行，提取GFP-LC3质粒；取对数生长期的HSC-T6细胞，以5×105个细胞/孔接种于6孔板中，继续培养24 h，使得细胞融合度达到70%～80%。参照LipofectamineTM2000转染试剂说明书，反复进行预实验进而优化转染条件，具体步骤：(1)分别用50 μL无血清DMEM高糖培养基稀释4.0 μg GFP-LC3质粒DNA和稀释10 μL Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀，室温静置5 min；(2)将稀释的DNA和脂质体轻轻混合，室温放置25 min，形成DNA-脂质体复合物；(3)每孔中加入100 μL DNA-脂质体复合物，在培养箱孵育4 h，再更换为DMEM高糖完全培养基，继续培养24、48、72 h；同时设置未转染对照组。采用荧光显微镜观察转染效果，证实质粒转染成功。CAPE继续作用于HSC-T6细胞继续培养24 h，以不加CAPE的空白组为对照组，同时给予自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA进行干预，进行荧光染色，采用荧光显微镜高倍视野下观察、拍照，采用Image J 软件进行分析。

1.2.5 荧光定量PCR检测 CAPE作用于HSC-T6细胞24 h后，收集细胞，按照E.Z.N.A®Total RNA试剂盒步骤提取总RNA。利用PrimeScript®RT Master Mix试剂盒步骤，于冰上配制20 μL反应体系，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，反转录合成cDNA。用qPrimer Depot软件设计目的基因Real-time PCR扩增引物，由上海生工合成，引物序列见表1。采用Bio-Rad PCR仪进行目的基因表达水平的检测，根据荧光定量PCR试剂盒SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ步骤，于冰上配制10 μL反应体系，预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 60 s，共40个循环。实验至少重复6次，Ct值被用作实时荧光定量的结果，△△Ct计算目的基因的相对表达量，以β-actin为内参对照，用2-△△Ct计算干预组相对于对照组的倍数变化。

1.2.6 Western-Blot检测 CAPE作用于HSC-T6细胞24 h后，收集细胞，RIPA裂解液提取总蛋白；根据BCA蛋白定量试剂盒步骤测定细胞总蛋白含量。具体步骤：(1)配制SDS-PAGE：凝胶根据待测目的蛋白分子量大小选择相应浓度的SDS-PAGE凝胶电泳；(2)上样：按每泳道150 μg目的蛋白分别加入到SDS-PAGE凝胶中，至溴芬兰抵达凝胶底部；(3)转膜：在Transfer Buffer中进行湿转，按蛋白分子量大小不同，40 V恒压转膜1～2 h；(4)封闭：取出PVDF膜置于5% BSA-TBST封闭液中室温轻摇封闭1 h；(5)一抗孵育：一抗稀释至合适的浓度，4 ℃孵育过夜；(6)二抗孵育：TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室温孵育1.5 h；(7)ECL显色：TBST洗膜3次，每次10 min，PVDF膜放入呈像系统观察拍照。

2 结果

2.1 CAPE对HSC-T6细胞超微结构的影响 不同浓度CAPE(5、10、15 μmol/L )作用于HSC-T6细胞24 h后，与对照组相比，CAPE干预组HSC-T6细胞的增殖明显受抑制，细胞体积逐渐下降，表面绒毛结构减少或消失，多核仁较少；有线粒体肿胀，内质网细长，在细胞质中观察到脂滴和盘状自噬体的散射分布(图1)。

2.2 CAPE对自噬相关基因表达的影响 不同浓度CAPE作用于HSC-T6细胞24 h后，与对照组相比，用10或15 μmol/L CAPE处理的HSC-T6细胞中ATG5、ATG7、ATG12、Beclin1、LC3 mRNA表达水平均显著增加(P值均<0.05)。然而，5 μmol/L CAPE干预组并未明显影响ATG5、ATG7、ATG12、Beclin1和LC3 mRNA的表达(P值均>0.05)(表2)。

注：黑色箭头，内质网；黄色箭头，线粒体；红色箭头，自噬体；最上方标尺5 μm，中间标尺1 μm，最下方标尺0.5 μm。

表1 Real-time PCR 引物序列

表2 CAPE对自噬相关的基因表达的影响

2.3 CAPE对LC3蛋白表达的影响 LC3B Ⅱ是自噬体的可靠蛋白质标志物，其表达水平与自噬体的数量呈正相关。与对照组(13.34%±2.59%)相比，CAPE干预组细胞形态皱缩变圆；且5 μmol/L CAPE(23.68%±3.76%，t=-5.553，P<0.001)、10 μmol/L CAPE(43.47%±3.83%，t=-15.958，P<0.001)、15 μmol/L CAPE(57.25%±2.78%，t=-28.334，P<0.001)LC3荧光染色均显著增强，且呈正相关(图2)。上述结果提示，随着CAPE浓度增加自噬体亦随之增多。

2.4 CAPE下调AKT/mTOR信号通路诱导自噬形成 为了进一步明确CAPE对自噬形成的影响，笔者团队将GFP-LC3转染至HSC-T6细胞中，发现CAPE干预组(79.01%±6.69%)较对照组(67.06%±6.74%)LC3荧光染色明显增强(t=-3.083，P=0.012)；同时给予自噬诱导剂雷帕霉素(86.88%±5.42%)，LC3表达较CAPE组明显增强(t=-2.239，P=0.049)；然而，给予自噬抑制剂3-MA(71.22%±4.29%)，其表达则明显减低(t=-2.404，P=0.037)。Western-Blot检测结果显示，ATG7、Beclin1和LC3I/Ⅱ的蛋白表达水平与GFP-LC3荧光染色结果相似；然而，AKT/p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平则与之相反(图3)。上述结果表明，CAPE可调节自噬过程，可能与下调AKT/mTOR信号通路相关。

3 讨论

自噬是一种维持细胞稳态的溶酶体途径，在自然界进化过程中作为一种保守且有效的内部保护监管机制，有利于生物体维持内环境的“稳态”，在一定程度上也决定着细胞的存活，同时过度的自噬也可介导自噬性的细胞死亡[5]。越来越多的研究表明，自噬在肝脏疾病中，尤其是在抗肝纤维化中发挥着较为重要的作用[5-7]。

大量的研究[1-2]表明，CAPE对各种肝脏疾病具有保肝作用。同时，本课题组前期研究发现，CAPE可以减轻CCl4复合因素诱导的肝纤维化[3]，但其具体作用机制尚不明确。HSC是肝纤维化形成的重要效应细胞，是其发生的核心环节。正常情况下HSC处于静息状态，但任何病因的慢性肝损伤(包括病毒感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝等)可引发静息HSC向其激活表型转化，如细胞增殖、收缩、纤维生成、基质降解能力减弱、趋化性和炎症信号等，使细胞外基质过度增生和沉积，从而促进肝纤维化的进程[8-9]。因此，本研究以大鼠HSC-T6为研究对象，初步探讨CAPE抑制肝纤维化进程的作用机制。本研究结果发现，电镜超微结构可直接观察到在CAPE干预组中，HSC-T6细胞的增殖明显受到抑制，且在细胞质中观察到脂滴和盘状自噬体的散射分布，进而证实了CAPE抑制HSC-T6细胞生长与自噬之间的相关性。由此，笔者团队以CAPE抗肝纤维化与自噬的关系为切入点进行研究。

注：a,LC3蛋白萤光染色情况；b,LC3蛋白萤光的定量分析。

众所周知，LC3B Ⅱ是自噬体的可靠蛋白质标志物，ATG蛋白家族是自噬吞噬过程中自噬体组形成所必需的，且Beclin1作为通过与Bcl-2相互作用的自噬蛋白家族关键调解蛋白，上述基因表达水平均与自噬体的数量呈正相关[10]。本研究结果显示，在CAPE干预组LC3 mRNA和蛋白表达水平均较对照组显著升高，且发现自噬相关基因ATG5、ATG7、ATG12、Beclin1亦显著升高，进而证实CAPE可通过诱导自噬发挥抗肝纤维化作用。因此，笔者团队进一步探究该作用机制途径。

既往研究[11]已证实，AKT/mTOR信号通路与自噬发生密切相关，抑制AKT和mTOR的磷酸化可以显著减轻肝纤维化。Lee等[12]发现芦丁和姜黄素等天然化合物可能通过mTOR依赖性途径诱导HSC发生自噬，进一步提出这些天然化合物对减轻肝纤维化有益处。Park等[13]进一步证明了间充质干细胞可以通过诱导自噬而改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化，并抑制TGFβ表达。由此，笔者团队将GFP-LC3质粒转染至HSC-T6细胞中，构建了LC3高表达的细胞模型，发现给予CAPE干预后，LC3表达明显增强，同时给予自噬诱导剂雷帕霉素后LC3

注：a,不同干预情况下，LC3蛋白荧光染色情况；b，LC3蛋白荧光的定量分析；c，不同浓度CAPE对AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。

表达亦显著增强，然而给予自噬抑制剂3-MA后显著减低。同时发现，自噬相关蛋白ATG7、Beclin1和LC3I/Ⅱ表达水平与LC3表达相似，而AKT/p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平则与之相反。上述结果均表明，CAPE可能通过下调AKT/mTOR信号通路诱导自噬发生，从而达到抗肝纤维化的治疗目的本研究仅仅从大鼠HSC株HSC-T6方面进行研究，认为CAPE可能通过抑制HSC-T6细胞增殖及可能的作用机制，从而为其抗肝纤维化作用提供有限的理论依据。而有关肝纤维化指标未在本研究提及，后续笔者团队将补充该方面的研究证据。同时，大鼠HSC株与人原代HSC又相差较远，在后续研究中宜补充人原代HSC、人肝纤维化组织及肝纤维化动物模型等方面研究，进一步阐明CAPE的抗纤维化作用。

综上所述，CAPE可抑制HSC的增殖，其作用可能是通过诱导HSC发生自噬，下调AKT/mTOR信号通路，使其处于新的“稳态”，进而有效地降低和延缓细胞外基质的产生，抑制肝纤维化进程。由此可知，CAPE有可能成为一种新型治潜在治疗和预防肝纤维化的药物，进而为CAPE治疗肝纤维化提供理论依据。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：杨宁、石娟娟、党双锁负责课题设计，资料分析，撰写论文；邓江、王怡恺、王文俊参与收集数据，数据分析；杨宁、邓江、王怡恺、常莎、高宁负责课题实验，实验数据分析；杨宁、石娟娟、党双锁负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。