彭启旺 邓浩 李威

胃癌起病隐匿，多数病人确诊时已处于中晚期[1-2]。晚期胃癌常出现侵袭或转移，即使行胃癌根治性切除术，也存在较高死亡风险[3]。早期识别胃癌术后早期复发的高风险病人并制定个性化治疗方案，对延长病人的生存时间具重要意义。长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)与胰腺癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤相关[4]。LncRNA通过调控染色体结构、基因转录、蛋白质翻译、蛋白质活性等等过程参与肿瘤的进展[5]。有研究表明，胃癌LncRNA通过募集 WDR5/KAT2A 复合物作为胃癌“支架”刺激肿瘤发生和转移[6]，LncRNAs的异常表达可能间接反映胃癌的发生发展。基因通常不会单独作用，因此有必要选择合适的LncRNA并建立多LncRNA预测模型，为评估胃癌早期复发提供指导。本研究分析胃癌病人术后早期复发相关LncRNA，构建基于LncRNA表达的胃癌病人术后早期复发的预测模型。

对象与方法

一、对象

2016年6月～2019年1月我院行胃癌切除术的病人121例。纳入标准：(1)病理检查确诊胃癌并行胃切除术和D2淋巴结清扫术[7]；(2)病人未进行术前化疗或放疗；(3)肿瘤分化为中、高分化；(4)病人或其家属知晓本研究并签署知情同意书。排除标准：合并其他部位恶性肿瘤；合并严重基础疾病，如心肺功能不全等；TNM分期≥Ⅲ期。剔除标准：术后半年内死亡；个人原因不能配合全程随访。本研究经过医学伦理委员会审查。

二、方法

1.LncRNA 表达检测：采用实时逆转录聚合酶链反应检测。逆转录试剂盒购于美国Invit rogen公司，胎牛血清购于美国Gibco公司，TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ 及PrimeScriptTM RT Master Mix购于日本Takara公司，LipofectamineTM 2000 转染试剂盒购于美国 Invitrogen 公司。

2.资料收集：收集病人一般资料，包括年龄、性别、淋巴结转移情况，疾病分期、肿瘤最大径、肿瘤位置，术后化疗情况等。

3.随访：随访病人复发情况。通过组织病理学检查确认病人是否复发。术后随访2年，共失访21例，最终纳入100例病人，其中31例病人出现复发为复发组，69例未复发的病人为未复发组。两组病人年龄、性别、临床特征等比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组病人临床资料分析

三、统计分析和数据预处理

结果

1.异基因筛选及胃癌病人术后早期复发的风险因素分析：在胃癌术后病人中，edgeR 共筛选出992个DEL，其中772个上调，220个下调，单变量分析显示，复发组与未复发组63 个 LncRNA 表达存在差异；Lasso-COX 回归模型分析显示，22个 LncRNA 是胃癌病人术后早期复发的风险因素；将22个 LncRNA 进一步纳入多变量 COX 回归分析中显示，AC007991.4、AC079385.3和AL109615.2是胃癌病人术后早期复发的强风险因素，见图1、2、3。

图1 红色表示上调的 LncRNA；绿色表示下调的 LncRNA

图2 通过十倍交叉验证法调节参数λ将模型中二项式偏差降到最小后筛选出的效能较好的特征集合

图3 森林图显示AC007991.4、AC079385.3和AL109615.2是胃癌病人术后早期复发的风险因素

2.验证集预测模型分析：绘制ROC曲线，AC007991.4、AC079385.3、AL109615.2及三者联合预测胃癌病人术后早期复发的效能均较高，见图4、表2。

图4 胃癌术后早期复发的ROC曲线

表2 预测模型ROC曲线参数

讨论

胃癌早期症状不明显，多数病人在确诊时已是晚期，5年总体生存率低于25%[8]。开发一种可应用于临床风险评估的预后分层系统，对于胃癌病人的治疗和随访具有重要意义。LncRNA 是一类与基因表达调控功能相关的分子[9]。随着LncRNA功能研究深入，越来越多的证据表明部分LncRNA在胃癌中异常表达并参与癌症进展调控。Li等[10]研究发现，MAFG-AS1促进胃癌细胞增殖和侵袭，可能是一种有价值的预后生物标志物；Cai等[11]研究表明，LncRNA pcsk2-2可作为胃癌诊断的生物标志物。然而，这些研究仅讨论了单一生物标志物的预测价值，但基因通常不会单独作用。因此，需要选择合适的LncRNA并建立多LncRNA预测模型。本研究纳入121例病人，评估LncRNAs的表达与胃癌病人术后复发间的相关性。

本研究通过TCGA 获得的RNA-seq数据显示，在胃癌病人中共筛选出992个DEL，其中772个上调，220个下调；其中共63个LncRNA与胃癌病人术后早期复发的风险相关；Lasso-COX回归及多变量COX进一步分析显示，AC007991.4、AC079385.3和AL109615.2是胃癌病人术后早期复发的独立风险因素，绘制ROC曲线显示其预测效能较高，可用于临床胃癌病人术后早期复发的早期预测。有研究认为，LncRNA在胃癌中异常表达，且其功能复杂。作为“支架”，可刺激蛋白质之间的相互作用[12]；作为“向导”，LncRNA 能够实现蛋白质和基因的混合[13]；作为“增强子”，LncRNA 控制基因的转录，作为“诱饵”，LncRNA 与 microRNA 或蛋白质结合参与癌症进展调控[14]。AC007991.4、AC079385.3和AL109615.2三种LncRNA在胃癌组织和细胞中的表达，AC007991.4在胃癌中弱表达，AC079385.3和AL109615.2都是潜在的onco-LncRNA。其中AC007991.4和AC079385.3都是反义LncRNA，位于8号染色体：39918076-39920890和12号染色体：106714924-106733066。目前关于AC007991.4和AC079385.3的分子功尚无完全明了。AL109615.2作为一种长基因间非编码RNA，位于6号染色体:44058792-44089288，可竞争性结合miR-133b与血管内皮生长因子C诱导结直肠癌细胞转移[15]。同时，在本研究中，为提高模型的预测准确性，以P<0.05和|logFC|≥1.5作为获得DEL的截止点，应用Lasso和COX回归分析来分析LncRNA的表达与胃癌病人术后复发的相关性。与以往研究相比，本研究有效地最小化了由单变量COX回归引起的过拟合。与传统模型相比，Lasso回归评估过程包括与回归岭的关系、最佳子集选择、套索系数估计之间的联系和软阈值，通过变量选择和正则化提高了预测精度和可解释性。

综上所述，AC007991.4、AC079385.3和AL109615.2是影响胃癌术后病人早期复发的因素，构建风险预测模型，可以指导重点人群检测，尽可能延长病人生存时间。本研究的不足之处在于纳入的样本量较少，且仅为我院胃癌病人，而基因表达常具人种差异，因此普遍性受限。随访时间为2年，随访时间较短，研究结果可能存在偏倚。后期需扩大样本纳入范围，延长随访时间。