时晓晓，董 翔，于若卉，苏君君，齐东东，白 杨，董 猛

（河北省沧州中西医结合医院a.肝胆外二科；b.耳鼻咽喉科，河北沧州 061000）

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床常见的恶性肿瘤，约占全部肝癌的70%～90%，致病、致死率较高，患者预后较差[1]。近年研究表明，肿瘤的发生发展是多因素、多步骤、多通路异常调控的复杂过程，涉及致癌基因的异常激活和抑癌基因的失活[2]。基于分子生物学的大量研究也表明，微小核糖核酸（microRNAs, miRNA,miR）在人类众多肿瘤中异常表达，可与mRNA转录本的3'-UTR区结合，促使mRNA降解或抑制其表达翻译，调控细胞生长、分化及迁移、凋亡等生物学行为[3]。证实miRNA能够调控促癌基因或抑癌基因，参与肿瘤的发生、发展及转移，为肿瘤研究提供了新方向[2]。miR-203a-3p是近年研究的miRNA分子，大量研究表明其在胃癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中异常表达，在肿瘤细胞增殖、侵袭及凋亡、耐药等过程中发挥重要作用，是许多疾病和癌症的潜在分子标记物[4-6]。相关研究表明，细胞内能量代谢改变是肿瘤细胞的特征之一，肿瘤细胞大多存在谷氨酰胺代谢增加和有氧糖酵解（Warburg效应）[7]。谷氨酰胺酶通过催化谷氨酰胺生成谷氨酸，提高谷氨酰胺代谢，为肿瘤细胞增殖提供足够能量，促进肿瘤的发生发展[8]。多数肿瘤细胞中肾型谷氨酰胺酶（Kidney-type glutaminase，GLS1）显著高表达，在细胞谷氨酰胺代谢及肿瘤生长中意义显著[9]。因此，本研究拟探究miR-203a-3p和GLS1对HCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其调控作用机制，旨在为临床HCC诊疗提供更多参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 HCC细胞系HepG2，HCCLM3，Huh7，Hep3B和人正常肝细胞株LO2购自中国科学院，37℃，5ml/dl CO2条件下培养在含10g/dl胎牛血清、1g/dl链霉素和青霉素的DMEM培养液中。另选取2021年7～8月由沧州中西医结合医院病理科留存的20例HCC患者癌组织及对应癌旁正常组织样本，均由术中获取经病理确诊后-80℃低温液氮保存；未并发其他恶性肿瘤，术前无相关放化疗及新辅助治疗史。

1.2 试剂和仪器 胎牛血清、链霉素、青霉素（四季青生物科技公司）；DMEM培养液、胰蛋白酶（武汉博士德生物科技有限公司）；TRIzol试剂、Lip 2000转染试剂（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（Aidlab公司）；CCK-8试剂盒，双重荧光素酶活性测定（Promega公司）；Transwell小室（美国BD Biosciences公司）；酶标仪（美国Bio-rad公司）；实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；β-catenin，p-GSK-3β，c-Myc抗体（Bio-RAD 公司）；谷氨酰胺代谢产物检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；miR-203a-3p mimic模拟物、miR-203a-3p inhibitor抑 制 物 及GLS1-3'UTR-wt野生型和3'UTR-mut突变型荧光质粒（广州锐博生物科技有限公司）；谷氨酰胺酶特异性小分子抑制剂968，沉默GLS1表达siRNA载体（上海吉玛基因生物）。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染及分组：取生长密度达80%时的待测细胞，参照Lipo 2000说明书进行转染，分组为 miR-203a-3p过表达组（mimic组），miR-203a-3p过表达阴性组（mimic-NC组），miR-203a-3p低表达组（inhibitor组），miR-203a-3p低表达阴性组（inhibitor-NC）；GLS1抑制组（转染谷氨酰胺酶抑制剂968），GLS1敲低表达组（siRNA组），GLS1敲低阴性对照组（siRNA-NC）。转染完成后常规培养48 h，行后续实验。

1.3.2 qRT-PCR检测目的基因表达：采用TRIzol试剂提取细胞、组织总RNA，反转录为cDNA，以此为模板配置PCR反应体系，2×SYBR Green Master Mix 5 μl，正 反 向 引 物 各2.5 μmol/L，cDNA 1 μl，无Rnase双蒸水，总体积20 μl；利用实时荧光定量PCR仪进行qRT-PCR扩增反应，反应条件：95℃ 35 s，95℃ 20 s，72℃15 s，循环40次。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA表达。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.3.3 细胞增殖能力检测：收集待测细胞接种到96孔板，密度1×104/孔，37℃，5%（v/v）CO2孵育48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μl，孵育72 h，450 nm处用酶标仪测量吸光度A值，绘制增殖曲线，每孔设3个复孔，实验重复3次取平均值。

1.3.4 细胞迁移能力检测：收集待测细胞接种到6孔板，密度4×106/孔，待生长铺满底板，10 μl枪头垂直孔板划痕，PBS冲洗3次，去掉划痕碎片，加入无血清培养基培养48 h，拍照观察分析。

1.3.5 细胞侵袭能力检测：Transwell小室上室底部铺Matrigel基质胶，室温晾干；取对数生长期待测细胞，胰酶消化，重悬，调整浓度1×105/ml；下室加入含10g/dl胎牛血清DMEM完全培养液500μl，上室加入细胞悬液200 μl，培养24 h；取出小室，吸干培养液，4g/dl多聚甲醛固定20 min，0.1g/dl结晶紫染色15 min，PBS冲洗2次，去除上室多余细胞，晾干，倒置显微镜下观察细胞数量。

1.3.6 Western blot检测Wnt/β-catenin通路关键蛋白表达：取待测细胞裂解提取总蛋白，BCA法检测浓度；取蛋白样品行SDS-PAGE电泳分离，转移到PVDF膜，5g/dl脱脂奶粉封闭2 h，PBST洗膜2次，加入β-catenin，p-GSK-3β，c-Myc一抗（1∶1 000）孵育过夜；次日洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，PBST洗膜3次，ECL化学显色，凝胶成像系统观察拍照，Image-J 软件行灰度值定量分析。

1.3.7 双荧光素酶报告基因实验：取各组细胞接种到6孔板，将GLS1野生型和突变型3'UTR区序列插入双荧光素酶报告基因质粒，后将包含miR-203a-3p结合位点在内的GLS1-3'UTR-WT野生型和3'UTR-Mut突变型荧光素酶报告质粒与miR-203a-3p mimic共染至待测细胞中培养48 h，使用荧光素酶活性测定试剂盒检测各组荧光素酶活性，实验重复三次取平均值。

1.3.8 生物信息学预测分析：利用TargetScan (http://www.targetscan.org/) 网站预测与miR-203a-3p存在结合位点的可能靶基因，并通过双荧光素酶报告基因实验验证两者的结合关系。

1.3.9 谷氨酰胺饥饿实验：取待测细胞按1×105个/孔接种在12孔板，待细胞贴壁后，分别用含/不含谷氨酰胺的DMEM培养液培养0，2，4，6天并计数，每隔一天更换一次培养液，绘制生长曲线，实验重复三次取平均值。

1.3.10 GLS1酶活性测定：采用线粒体提取试剂盒提取分离细胞得到线粒体，采用两步法进行酶活性检测；按说明书配制第一步反应液，将线粒体提取物加入其中，37℃旋转孵育1 h，加入HCl终止反应；配制第二步反应液，将其与终止反应的第一步反应液混合，室温孵育45 min，340 nm处以去离子水作为空白，测定最终吸光度值。

1.3.11 谷氨酰胺代谢检测：①α-酮戊二酸（α-Ketoglutaric acid，α-KG）检测：取待测细胞制成细胞悬液，处理去除悬液中存在的各类酶类；96孔板每孔加入50μl相应反应混合液，37℃避光反应30 min，570 nm处用酶标仪检测各孔吸光度值，绘制标准曲线，计算各组α-KG含量。②谷氨酸检测：取待测细胞同样制成细胞悬液，离心，吸去上清，吹打混匀，离心，弃上清液；重悬细胞，计数，超声破碎仪破碎细胞，离心，留取上清待测；按照检测试剂盒说明书检测计算各组细胞中谷氨酸含量。

1.4 统计学分析 采用软件SPSS 19.0进行数据分析，数据采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验；癌组织及癌旁组织中差异比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC组织及细胞中miR-203a-3p表达 qRTPCR检测显示，HCC癌组织中miR-203a-3p表达（0.32±0.07）明显低于癌旁正常组织（1.02±0.03），差 异 有 统 计 学 意 义（t=41.105，P＜0.001）；HCC细 胞HepG2（0.34±0.05），HCCLM3（0.58

±0.06），Huh7（0.43±0.05），Hep3B（0.29±0.04）中miR-203a-3p相对表达水平亦明显低于人正常肝细胞LO2（1.01±0.02）中miR-203a-3p表达水平，差异有统计学意义（F=119.080，P＜0.001），其中Hep3B细胞表达最低，故选择该细胞用于后续实验。

2.2 miR-203a-3p对HCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响 见表2。 qRT-PCR 检测显示，与Blank组（1.01±0.02）相比，miR-203a-3p 过表达组细胞中miR-203a-3p相对表达（2.32±0.14）明显升高，miR-203a-3p 低表达组细胞中miR-203a-3p相对表达（0.26±0.05）明显降低，差异有统计学意义（t=16.044，24.123，均P＜0.001），提示过表达/敲降miR-203a-3p细胞系构建成功。细胞实验检测显示，miR-203a-3p过表达组Hep3B细胞增殖、迁移率和侵袭能力较对照组明显抑制，组间差异具有统计学意义（t=14.849，13.900，10.562，均P＜0.001）；反之敲降miR-203a-3p表达组细胞增殖、迁移和侵袭能力明显增加，组间差异具有统计学意义（t=10.135，8.995，9.577，均P＜0.001）。提示HCC中miR-203a-3p扮演抑癌基因作用。

表2 miR-203a-3p表达对HCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响（±s）

表2 miR-203a-3p表达对HCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响（±s）

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2.3 miR-203a-3p靶基因的预测及验证 生物信息学数据库检索显示，miR-203a-3p与GLS1 3'UTR区存在结合位点，见图1。通过构建GLS1 3'UTR-野生型和突变型质粒，经双荧光素酶基因报告实验 验 证 发 现，转 染miR-203a-3p mimic组GLS1 3'UTR-WT型质粒荧光活性较转染mimic-NC组明显降低（0.43±0.05 vs 1.02±0.01），差异有统计学意义（t=20.041，P＜0.001）；转染miR-203a-3p mimic组GLS1 3'UTR-Mut型质粒荧光活性与转染mimic-NC组（0.98±0.03 vs 1.01±0.01）未见明显变化，差异无统计学意义（t=1.643，P=0.176），表明GLS1是miR-203a-3p的靶基因。进一步检测 发 现，miR-203a-3p mimic组（0.34±0.08）中GLS1表达较Blank组（1.01±0.02）明显降低，差异有统计学意义（t=14.073，P＜0.001）；敲降miR-203a-3p inhibitor组（1.96±0.14）中GLS1表达较Blank组（1.01±0.02）明显升高，差异有统计学意义（t=11.635，P＜0.001），提示miR-203a-3p靶向负调控GLS1表达。

图1 生物信息学网站检索miR-203a-3p的靶基因

2.4 HCC细胞对谷氨酰胺的依赖性 见图2。谷氨酰胺饥饿实验显示，在含谷氨酰胺的培养基中Hep3B和LO2细胞持续生长，但LO2生长缓慢；在不含谷氨酰胺的培养液中Hep3B细胞生长明显抑制，LO2细胞生长不受影响。表明HCC细胞对谷氨酰胺存在明显的依赖性。

图2 HCC细胞对谷氨酰胺的依赖性

2.5 HCC细胞中GLS1表达及活性 qRT-PCR检测显示，HCC细胞HepG2（2.54±0.04），HCCLM3（2.02±0.03），Huh7（1.76±0.05），Hep3B（2.26±0.04）中GLS1相对表达水平明显高于人正常肝细胞LO2中GLSI表达水平（1.01±0.01），差异有统计学意义（F=763.254，P＜0.001）。酶活性测定结果显示，HCC细胞HepG2（2.31±0.05），HCCLM3（1.57±0.03），Huh7（1.42±0.04），Hep3B（2.25±0.03）中GLS1酶活性明显高于人正常肝细胞LO2（1.00±0.01），差异有统计学意义（F=787.125，P＜0.001），尤以HepG2、Hep3B细胞表达最为显著，表明HCC细胞中GLS1高表达呈现高酶活性。

2.6 抑制GLS1抑制HCC细胞谷氨酰胺代谢 qRTPCR检测显示，与Blank组（1.01±0.02）相比，转染siRNA1-GLS1（0.37±0.06），siRNA2-GLS1（0.44±0.05）和siRNA3-GLS1（0.21±0.03）载体组细胞中GLS1相对表达明显降低，差异有统计学意义（F＝197.014，P＜0.001），其中siRNA3组降低最显著。Western blot实验检测显示，GLS1抑制组中GLS1蛋白（0.28±0.03）表达较Blank组（1.00±0.01）和阴性对照DMSO组（0.98±0.02）明显降低，差异有统计学意义（F＝1 080.857，P＜0.001），见图3，证实GLS1表达抑制有效。研究检测各组细胞内谷氨酰胺代谢产物水平发现，转染siRNA-GLS1后，Hep3B细胞中α-KG和谷氨酸水平均较对照组明显降低，差异有统计学意义（t＝10.387，7.381，均P＜0.001），见表3。

图3 Western blot检测加入抑制剂968对GLS1蛋白表达的影响

表3 抑制GLS1对HCC细胞谷氨酰胺代谢产物表达水平的影响（±s）

表3 抑制GLS1对HCC细胞谷氨酰胺代谢产物表达水平的影响（±s）

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2.7 miR-203a-3p靶向GLS1对HCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响 见表4。细胞实验检测显示，GLS1抑制组Hep3B细胞增殖、迁移、侵袭能力较对照组明显降低，差异均有统计学意义（t＝16.499，16.278，11.215，均P＜0.001）；在miR-203a-3p inhibitor组共转染抑制GLS1表达后，miR-203a-3p对HCC细胞增殖、迁移、侵袭的作用被逆转，inhibitor组、inhibitor+ siRNA组与Blank组比较，差异均有统计学意义（t＝10.371，16.482，10.418；4.950，13.190，4.808，均P＜0.001）。

表4 miR-203a-3p调控GLS1对HCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响（±s）

表4 miR-203a-3p调控GLS1对HCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响（±s）

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2.8 miR-203a-3p靶 向GLS1对Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的影响 Western blot检测显示，miR-203a-3过表达组和GLS1抑制组β-catenin，p-GSK-3β，c-Myc蛋白表达水平较对照组明显降低，差异有统计学意义（t＝14.184，25.828，22.323；11.129，28.213，22.961，均P＜0.001）；GLS1抑 制 组β-catenin，p-GSK-3β，c-Myc蛋白表达水平较siRNA+ inhibitor组明显降低，差异有统计学意义（t＝9.602，18.676，16.902，均P＜0.001）。在抑制GLS1表达组共转染miR-203a-3p inhibitor后，Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达水平被逆转恢复，见图4和表5，说明miR-203a-3p通过靶向GLS1调控Wnt/β-catenin信号通路活性参与HCC的发生发展。

表5 miR-203a-3p调控GLS1对Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的影响（±s）

表5 miR-203a-3p调控GLS1对Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的影响（±s）

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图4 miR-203a-3p和GLS1对Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的影响

3 讨论

近年发现，多种非编码RNA在疾病的发生发展中具有重要调控作用，得到临床广泛关注[2-3]。研究表明，miRNA主要参与基因转录后水平，可通过多种方式和途径调节细胞的分化、代谢及侵袭转移等过程[3]。不同miRNAs在不同肿瘤中的表达调控作用及调控的下游靶基因也不同，既可以发挥原癌基因作用，也可发挥抑癌基因作用，进而影响不同信号通路的激活或抑制，参与调节疾病的发生，是新的肿瘤分子标记物及治疗靶点[10]。

研究表明，miR-203a-3p在多种肿瘤中表达下调，被认为是肿瘤抑制因子。如研究报道，胃癌中miR-203a-3p靶向胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）发挥抑癌作用，参与调控了胃癌细胞的增殖及细胞周期[4]。MiR-203a-3p通过调节SLUG抑制胰腺癌细胞增殖、上皮细胞-间充质转化（EMT）和凋亡[6]。MiR-203a-3p通过靶向ATM介导Akt/GSK-3β/Snail信号通路，调控卵巢癌细胞的增殖、迁移、凋亡等生物学行为[11]。结直肠癌[12]、非小细胞肺癌（NSCLC）[5]等肿瘤细胞中也发现miR-203a-3p表达异常，参与了疾病的发生发展，表现出原癌或抑癌基因属性。本研究发现，HCC组织、细胞中miR-203a-3p表达下调，细胞实验发现miR-203a-3p过表达能够抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭，提示miR-203a-3p发挥抑癌基因作用，与陈昶舟等[13]研究结果一致。

研究利用生物信息学分析证实GLS1是miR-203a-3p的目标靶基因，miR-203a-3p靶向负调控GLS1。研究表明，基因改变、能量代谢变化及局部微环境改变对肿瘤的发生发展至关重要[14]。对细胞能量代谢的研究表明，谷氨酰胺和葡萄糖是肿瘤的主要能量来源，癌细胞能量代谢除了表现出Warburg效应外，细胞对谷氨酰胺的利用速度远超于其他氨基酸，提示谷氨酰胺依赖是肿瘤细胞能量代谢的关键[14]。并有研究指出，谷氨酰胺代谢过程中，谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶催化转化为谷氨酸，谷氨酸在转氨酶作用下又转化生成α-酮戊二酸（α-KG）、谷胱甘肽等重要生化代谢中间产物，为肿瘤细胞提供能量，降低活性氧（ROS）水平，维持细胞氧化还原[15]。谷氨酰胺酶表达下调时细胞氧耗减少，相关性ATP及谷胱甘肽水平下降，ROS水平增高，细胞凋亡增加[16]。多种肿瘤细胞内谷氨酰胺代谢异常，谷氨酰胺酶在谷氨酰胺代谢过程中至关重要[17]。另有研究报道，GLS1催化谷氨酰胺转化介导肿瘤细胞能量代谢，参与了多种肿瘤的EMT及侵袭、耐药[17]。GLS1通过降低ROS水平调节细胞抗氧化防御，维持了细胞的氧化还原稳定性[18]。MiR-23a通过靶向GLS1可调控H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞的增殖和迁移[19]。而本研究发现，HCC细胞生长对谷氨酰胺高度依赖，HCC细胞中GLS1高表达呈现高酶活性，抑制GLS1表达后谷氨酰胺代谢抑制，提示GLS1高酶活性表达，细胞谷氨酰胺代谢增强，促进了HCC细胞的生长及恶性进展。同时还发现，抑制GLS1表达后HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力被抑制，GLS1能够逆转miR-203a-3p对HCC细胞生物学的作用，提示miR-203a-3p可通过靶向GLS1参与调节HCC细胞的生物学行为，由GLS1介导的谷氨酰胺依赖可能是HCC的潜在治疗靶点。

相关信号通路的激活或失活是肿瘤基因发挥作用的重要途径，Wnt/β-catenin信号通路参与调控细胞的生长、分化及凋亡，其失调被认为是引起人类恶性肿瘤发生进展的启动因素[20]。现有研究表明，谷氨酰胺能激活重要的信号转导通路，介导维持细胞的存活和增殖，参与调控肿瘤的发生、转移及耐药，发现Wnt/β-catenin信号通路可以介导调节肿瘤细胞代谢，影响ROS表达调节，参与肿瘤进展[21-22]。Wnt通路相关Myc基因异位表达能增加谷氨酰胺酶的表达，促进细胞谷氨酰胺代谢，促进肿瘤细胞对谷氨酰胺的依赖性[9]。此外，ZHAO等[24]研究报道，肾癌中c-Myc通过增强GLS1表达可促进谷氨酰胺降解；QING等[25]研究也表明，神经母细胞瘤中ATF4调节Myc介导肿瘤细胞谷氨酰胺剥夺，促进细胞死亡。基于此本研究经探究miR-203a-3p调控GLS1对Wnt/β-catenin通路活性的影响，显示miR-203a-3过表达和抑制GLS1表达均能使Wnt/β-catenin通路失活，而miR-203a-3p低表达能够逆转GLS1对该通路的抑制作用。本研究结果表明，miR-203a-3p可能通过靶向GLS1调控Wnt/β-catenin信号通路活性参与HCC的发生发展。然肿瘤发生发展的作用机制复杂，miR-203a-3p靶向GLS1调控HCC发生进展的分子作用还需进一步继续探究。

综上所述，MiR-203a-3p过表达能够抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭，可能与GLS1调控细胞内谷氨酰胺代谢及miR-203a-3p靶向GLS1调控Wnt/β-catenin信号通路活性有关。