李慧敏，杨 琳（陕西省核工业二一五医院产科，陕西咸阳 712000）

稽留流产是一种特殊的流产类型，也叫胎停育，指胚胎或胎儿已死亡滞留宫腔内尚未自然排出者。稽留流产比例呈逐年上升趋势，在早期正常妊娠中高达15%～20%，其与多种因素相关，如生活环境、感染、免疫及内分泌、染色体异常等，发病机制十分复杂，至今仍未明确[1]。死亡的胚胎及病变的胎盘组织滞留于宫腔中释放凝血活酶，易引发凝血功能紊乱，严重威胁了女性的健康[2]。因此，明确稽留流产的发病机制，有助于该病的早期预防和治疗。蛋白亮氨酸拉链基序1（leucine zipper motif 1, APPL1）是绒毛膜滋养细胞中的差异蛋白之一，APPL1蛋白可能是诱导稽留流产发生发展的关键因子[3]。研究表明，稽留流产的发病机理与APPL1蛋白调节信号通路抑制氧化应激有关[3]。核因子E2相关因子（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一种对氧化还原敏感且广泛表达的蛋白，能够调节参与抗氧化作用。核因子E2相关因子/抗氧化反应元件（Nrf2/ARE）是最重要的内源性抗氧化应激通路，也是机体抗氧化应激的主要承担者，当机体遭受有害刺激时，其可抵抗外界氧化刺激导致的氧化应激反应，保护机体免受损伤[4]。研究表明，当细胞受到活性氧（reactive oxygen species, ROS）等的刺激时，Nrf2可与其抑制剂Keap1结合活化，转运入核与ARE结合，激活靶基因调控抗氧化酶、II相代谢酶，如血红素加氧酶1（haem oxygenase 1 ，HO-1），醌氧化还原酶1及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）等，发挥抗氧化损伤作用[5]。研究表明，HO-1具有与ARE相似的抗氧化元件，可通过Nrf2调控ARE形成Nrf2/HO-1通路[6]。因此本研究探究分析了稽留流产患者绒毛组织中APPL1，Nrf2和HO-1表达与氧化应激的相关性，探讨了其在稽留流产发生中的意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2020年6月～2021年6月在陕西省核工业二一五医院诊断为稽留流产并行人流术的46例患者进行研究，另选取同期要求行人工流产术的50例正常早孕妇女作为对照组，两组年龄23～36岁，月经规律，停经6～11周。实验组平均年龄31.5±2.9岁，平均身体质量指数（body mass index，BMI）23.4±3.1kg/m2，平均胎龄6.7±0.9周，平均孕次2.4±0.6次，平均流产次数2.0±0.4次；对照组平均年龄30.7±2.8岁，平均BMI 23.9±3.2 kg/m2，平均胎龄6.8±0.9周，平均孕次2.3±0.5次，平均流产次数2.1±0.3次。两组患者年龄、BMI，胎龄、孕次、流产次数等基线资料差异均无统计学意义（P＞0.05）。医院伦理委员会批准本研究，患者及家属均知情同意。

纳入标准：①实验组：B超检查示宫内妊娠囊＞2cm，未见胎心管搏动，未见胚芽或胚芽长度＞1cm；有停经史；清宫术前宫口未开。②对照组：超声证实胚胎发育正常，有心管搏动；既往无死胎、自然流产及死产史；无腹痛、阴道流血等先兆流产症状。排除标准：①子宫肌瘤、宫腔黏连、子宫畸形、子宫腺肌症等；②母体伴有严重贫血、感染并发慢性肝肾疾病、心血管疾病、多囊卵巢综合征、甲状腺功能减退症及糖尿病等；③孕期有药物、毒物、射线接触史等；④有家族遗产病史。

1.2 试剂与仪器 SP免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒（北京中杉金桥有限公司）；兔抗人APPL1单抗，Nrf2单抗，HO-1单抗（英国Abcam公司）；ROS，SOD，丙二醛（malondialdehyde, MDA）检测试剂盒（上海碧云天生物公司）；电泳仪、凝胶图像分析仪（美国Bio-Rad公司）；RIPA蛋白裂解液、PVDF膜（美国 Sigma-Aldric公司）；BCA蛋白检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；酶标仪（美国 Thermo Fisher 科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：采用负压吸引术吸出孕囊后，用无菌生理盐水洗掉黏液和血液，剔除蜕膜组织，医用滤纸吸去水分，分离出绒毛组织冲洗干净，分为3份，2份置于高压灭菌冻存管，迅速放入液氮管中-80℃超低温保存；另1份用10g/dl中性福尔马林溶液固定24h，脱水、包埋，制为样本蜡块。

1.3.2 免疫组织化学染色检测绒毛组织中APPL1，Nrf2和HO-1表达：取蜡块组织样本4 μm厚度切片，脱蜡、脱水，抗原高压修复；3g/dl过氧化氢去除内源性过氧化氢酶活性，滴加APPL1，Nrf2和HO-1一抗覆盖组织，4℃冰箱孵育过夜；第2天滴加二抗，室温孵育20min，DAB试剂盒避光显色，苏木素复染，脱水，封片，镜下观察拍照。

1.3.3 免疫组织化学结果判定：APPL1，Nrf2和HO-1阳性染色呈黄色、棕黄色或棕褐色，阴性对照无着色。随机选取高倍镜下6个视野，根据染色强度和阳性细胞百分比进行计分，着色强度：以无着色(-)、黄色 (+)、棕黄色(++)和棕褐色(+++)分别计为0～3分；阳性细胞百分比；以≤5%，6%～25%，26%～50%，51%～75%和＞75%分别计为0～4分。免疫组织化学总得分为两项计分的乘积，＜4分定义为阴性，≥4分定义为阳性。

1.3.4 蛋白免疫印迹（Western blot）检测：取绒毛组织100 mg，加入RIPA蛋白裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度；电泳分离蛋白，转移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，室温封闭1 h，加入对应蛋白一抗，4 ℃过夜；次日室温下加入二抗孵育1 h，洗膜3次，ECL发光显色。采用ImageJ 软件定量分析各条带的灰度值，以β-actin为内参进行显影拍照，蛋白定量表达采用均数±标准差（±s）表示，实验重复三次取平均值。

1.3.5 氧化应激指标检测：从-80℃超低温冰箱取绒毛组织约100mg，加入RIPA蛋白裂解液1 ml，充分匀浆后4℃，12 000 r/min离心30 min，弃去沉淀，将上清液转移至EP管，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定ROS，SOD和MDA含量，操作如下：按ELISA检测说明书设置空白孔、标准孔和待测样品孔，每组设3个平行孔，除空白孔外在酶标板各孔加入制备的标准品50μl，再加入辣根过氧化物酶标记抗体100 μl，封膜板覆盖酶标板，37℃孵育1h，弃去孔内液体，洗板5次，于各孔加入显色底物，避光孵育15 min，后加入终止液100 μl/孔，混匀后上机，在酶标仪450nm 处测定各孔吸光度值，拟合标准曲线，计算样品中ROS，SOD和MDA含量。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验；Pearson分析APPL1，Nrf2和HO-1表达与氧化应激指标的相关性；计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绒 毛 组 织 中APPL1，Nrf2和HO-1蛋 白 的定位表达 免疫组化法检测显示，绒毛组织中APPL1，HO-1阳性表达定位主要分布于细胞胞浆，Nrf2阳性表达定位主要分布于细胞胞浆或胞核，呈黄色、棕黄色或棕褐色，见图1。实验组绒毛组织中APPL1，Nrf2和HO-1蛋白表达阳性率均低于对照组，免疫组化染色评分亦低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

图1 绒毛组织中APPL1蛋白免疫组化图（×200）

表1 两组绒毛组织中APPL1，Nrf2，HO-1蛋白表达比较

2.2 两组APPL1，Nrf2和HO-1蛋白定量表达及氧化应激指标水平分析 见表2和图4。Western blot检测结果显示，与对照组相比，APPL1，Nrf2和HO-1蛋白在实验组绒毛组织中的表达显著降低，差异有统计学意义（均P＜0.05）。 实验组绒毛组织中氧化应激指标ROS，MDA水平较对照组明显升高，SOD水平则明显降低，差异有统计学意义 （均P＜0.05）。

图2 绒毛组织中Nrf2蛋白免疫组化图（×400）

图3 绒毛组织中HO-1蛋白免疫组化图（×400）

图4 Western blot电泳蛋白表达图谱条带图

表2 两组APPL1，Nrf2，HO-1蛋白定量表达及氧化应激指标水平比较（±s）

表2 两组APPL1，Nrf2，HO-1蛋白定量表达及氧化应激指标水平比较（±s）

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2.3 稽留流产绒毛组织中APPL1，Nrf2和HO-1蛋白表达与氧化应激的相关性 见表3。稽留流产绒毛组织中APPL1，Nrf2，HO-1蛋白表达与ROS，MDA水平均呈负相关（均P＜0.05），与SOD水平均呈正相关（均P＜0.05）。

表3 APPL1，Nrf2，HO-1蛋白表达与氧化应激指标的相关性分析

3 讨论

稽留流产的处理较为困难，由于胎盘组织机化，与子宫壁紧密条件下黏连，导致刮宫困难。一般月份稍大的流产物留滞宫腔时间较长会导致机体凝血功能障碍，引发相关并发症的发生，而清宫会使子宫内膜损伤诱发宫腔黏连，甚至不孕，严重影响患者身心健康[7]。研究表明，稽留流产的发生与机体氧化应激状态密切相关[3]。APPL1是一种介导脂联素信号转导的调节蛋白，研究表明，APPL1通过调节多个信号通路参与各种生物学行为，如细胞黏附、代谢、迁移、凋亡和增殖等[8-9]。有研究发现，脂联素通过激活AdipoR1/APPL1/LKB1/AMPK信号通路的促进细胞内抗氧化系统来清除ROS，降低由于缺血缺氧诱导的神经元凋亡[10]。研究表明，APPL1过表达可促进瘦素诱导的癌细胞中STAT3，ERK1/2和Akt磷酸化，增强癌细胞的增殖和迁移，反之可抑制癌细胞增殖和迁移，揭示了瘦素促进癌细胞运动和生长的新机制[11]。APPL1参与组成的脂联素可增强细胞的抗氧化能力，通过AdipoR1/APPL1信号传导抑制细胞凋亡水平和ROS水平。Nrf2在正常状态下存在于细胞质中，与KEAP1相结合后降解，当机体存在氧化应激状态时，Nrf和KEAP1无法被蛋白酶体降解，积累在细胞质中并向细胞核内转移，激活HO-1在内的下游抗氧化基因。研究证实APPL1-AdipoR1复合物脂联素可促进Nrf2核易位，激活Nrf2相关抗氧化信号通路进而抑制氧化应激反应[12]。

在正常妊娠11周之前，胚胎和胚盘生长于低氧（氧浓度2%～5%）环境中。为维持低氧环境，降低有氧代谢产生的ROS，大量抗氧化剂及抗氧化信号通路被激活，平衡氧化还原状态，以维持正常妊娠[13]。孕早期处于低氧状态的绒毛间隙可使胎儿免受ROS的侵害，而过量ROS具有细胞毒性，逸入细胞内可造成滋养细胞的细胞膜、染色液、蛋白及DNA损伤，或者对细胞基质胶原蛋白造成损伤，导致滋养细胞功能下降或部分细胞死亡，母体血提前流入容貌间隙，对母胎界面造成不可逆的损伤，胎儿受ROS侵害而死亡[14]。稽留流产患者的绒毛组织中ROS，MDA水平显著升高，使胚胎细胞处于高氧状态，从而抑制了SOD生成，介导胚胎停育。既往研究表明，当ROS异常升高或快速波动时会干扰滋养细胞的正常功能，从而导致多种类型的早期流产，如反复性流产、自发性流产和葡萄胎等[15-16]。SOD是一种重要的抗氧化金属酶，发挥抗氧化剂的作用，可将氧离子转化为H2O2和氧分子。稽留流产患者绒毛组织中ROS水平升高，SOD活性降低，氧化应激是稽留流产的发病机理之一[17]。当绒毛组织中ROS的大量产生会造成组织中的滋养细胞、内皮细胞发生氧化损伤，细胞结构中的脂质成分被氧化所形成的MDA能够反映氧化损伤的程度[15]。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，存在于氧代谢细胞中，可有效清除自由基，降低MDA对细胞及组织的破坏作用。细胞内存在一些复杂的抗氧化防御系统，目的是对抗ROS积累和氧化应激损伤，其中Nrf2被认为是一种对氧化还原敏感且在机体内广泛表达的蛋白，调节并参与抗氧化机制，诱导一系列抗氧化蛋白基因转录；HO-1是受Nrf2调节的最重要的基因之一，在细胞中发挥重要的抗炎、抗氧化调节作用。HO-1可通过胆绿素还原酶将血红素降解为胆绿素、CO和Fe2+，胆绿素及其还原型胆红素具有直接清除ROS的能力，构成内源性保护物质来调节细胞氧化、凋亡等多种生物学细胞活动[18]。

基于既往研究报道，本研究结果显示，实验组绒毛组织中APPL1，Nrf2和HO-1蛋白阳性率及表达水平较对照组显著降低，提示三者的异常表达可能与稽留流产有关，Nrf2/HO-1信号通路在稽留流产者中受到抑制，与XIE等[19]报道一致。ELISA法检测结果显示，实验组绒毛组织中ROS，MDA水平均高于对照组，SOD水平低于对照组，提示机体氧化/抗氧化物质失衡参与了稽留流产的发生及病情进展。进一步分析发现，实验组绒毛组织中APPL1，Nrf2和HO-1表达与ROS，MDA水平均呈负相关，与SOD水平呈正相关，提示APPL1，Nrf2和HO-1蛋白的异常表达与氧化应激的发生相关。本研究从氧化应激失衡角度探究表明，APPL1，Nrf2和HO-1的异常表达可能通过介导氧化应激反应的发生，从而诱导了稽留流产的发生，为稽留流产的发病、诊治提供了思路。然而本研究结果较为表浅、局限，APPL1调控Nrf2/HO-1通路参与氧化应激介导稽留流产发生的机制还有待通过细胞学实验探究验证。

综上所述，APPL1，Nrf2，HO-1在稽留流产绒毛组织中低表达，且与氧化应激指标ROS，MDA和SOD水平具有显著相关性，其三者异常表达可能通过介导氧化应激失衡进而诱导了稽留流产的发生。