王灿，屈用函，王绍祥，赵强彪，谢志强，张雪廷

（文山州农业科学院，云南 文山 663000）

随着植物根际微生物组（rhizosphere microbiome）研究的开展，根际微生物研究新技术新方法、根际促生菌资源筛选与应用、植物/微生物互作信号与调控机制、根际微生物与植物逆境响应机制、根际微生物与耕作土壤修复、根际微生物与植物生长发育等已成为研究的热点，同时也为绿色农业发展、环境生态保护提供理论指导和技术支撑［1-3］。根际微生物和植物息息相关、密不可分，研究表明植株通过根系向土壤中分泌糖类、氨基酸、酶类、酚酸类、有机酸、生长因子、抗菌物质等来影响根际周围的土壤微生物环境［3-5］，选择性“招募”对自己有益的微生物来协助自身生长发育和抵御各种非生物因素干扰及生物胁迫。

文山州地处云南边界，位于云南省东南部低纬度高原地区。作为云南最大的辣椒种植地，文山州具有丰富多样的辣椒种质资源［6］。小米辣（Capsicum frutescensL.）是茄科辣椒属一年或多年生灌木状辣椒（冷凉地区1年生，热区多年生），主产于中国西南边陲，含有丰富的矿质元素和微量元素，具有独特芳香和辛辣味，深受当地人民喜爱。育种者也培育出了一些耐瘠、耐旱、株型大、丰产的优良小米辣新品种［7］。但目前与辣椒相关的研究主要集中于1年生辣椒（Capsicum annuumL.）如朝天椒等，与小米辣相关的研究却鲜有报道。为促进小米辣育种与栽培工作，本研究采用16S rDNA对本地小米辣根际土壤细菌群落组成进行扩增子测序，旨在探明不同品种小米辣根系分泌物对其根际细菌群落定植的影响，分析之间群落结构差异，为小米辣生长地下部分与微生物的互作关系、根际细菌指示物种分析、筛选研究奠定基础。这对于了解不同环境下土壤微生物多样性与种植环境的相关性，确定小米辣根系分泌物调节微生物群落构建的主要因素等工作具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

灌木辣椒（Capsicum frutescensL.）本地野生品种小米辣‘M218’（X处理）和人工选育品种小米辣‘M240’（Y处理）由文山州农业科学院张雪廷老师提供（图1）。育苗基质为‘湘正农科’牌商品育苗基质，由湖南农业大学湘晖农业技术研究所研制，主要成分是草炭土。土 壤 基质性质如下：碱解氮（92.30±0.39）mg/kg、速效磷（54.56±0.45）mg/kg、速效钾（938.72±0.11）mg/kg、碳 氮 比1.47±0.55、pH5.28±0.030、EC值（712.67±0.17）μs/cm。

图1 辣椒试验材料果实表型示意图

1.2 方法

1.2.1 盆栽试验及样品采集

试验地点为文山州农业科学院，时间为2021年9月至2022年5月。试验共2个处理，每个处理3次重复，每盘为一次生物学重复，分别是小米辣‘M218’（X处理）和小米辣‘M240’（Y处理）。

将发芽整齐一致的辣椒种子播种于苗盘（27孔）中进行盆栽试验，常规管理育苗。苗龄为70 d时，采用5点取样法选取植株，将植株整株拔出，抖落附着土壤基质后用单独无菌刷刷取粘附在根表面的土壤基质，各处理的5棵苗混合为1次重复后放入50 mL无菌离心管中，迅速置于干冰中保存运输，后放入-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 测定项目

使用Magen核酸提取试剂盒（MagPure Soil DNA KF Kit），Equalbit dsDNA HS Assay Kit检 测DNA浓 度。以20—30 ng DNA为 模 板，由GENEWIZ,Inc（South Plainfield，NJ）公司完成二代测序文库构建和测序。16S rDNA上包括V3及V4的2个高度可变区，通过Illumina MiSeq进行双端测序。引物系列如下：

1.2.3 数据质控与分析

原始数据整理采用Office 2019软件。测序数据质量优化使用Cutadapt 1.9.1、Vsearch 1.9.6、Qiime 1.9.1。作 图 采 用GraphPad Prism 9.0、Office 2019。测序数据优化后质量见表1。

表1 测序数据质量

2 结果与分析

2.1 根际细菌群落结构分析

从图2a可以看出，共有OTU数为379个，其中‘M218’独有OTU为3个，‘M240’独有的OTU为1个。门水平下共获得13个物种种类（图2b），第一大优势菌群是变形菌门（Proteobacteria），各样本中分别占61.29 %和63.76 %，其次是拟杆菌门（Bacteroidetes），各样本中分别占13.55 %和12.08 %。放线菌门（Actinobacteriaz）中‘M218’和‘M240’分 别 是6.17 %和5.68 %。属水平下（图2c），鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）是第一大优势菌属，但‘M218’（14.88 %）高于‘M218’（7.11 %）。说明种植不同辣椒品种对其根际微生物群落物种丰度存在一定的影响差异。

图2 不同样本细菌群落结构描述

2.2 根际细菌群落多样性分析

α多样性 比 较中，Ace和Chao1是 反 映菌群丰富度的指标，数值越小表明丰富度越低。Shannon、Simpson是反映菌群多样性的指标，其数值越小表明群落多样性越低。X处理和Y处理均无显著差异，说明小米辣‘M218’和‘M240’的根际细菌群之间无明显差异（表2）。

表 2 不同样品细菌菌多样性指数

但在基于Unifrac距离PCoA分析（Adonis：R2=0.319，P=0.031）中，两个处理间差异显著，图中样本点距离的远近代表了样本中微生物群落的相似性，距离越近相似度越高。第一主坐标对样本差异的贡献率为41.96 %，第二主坐标对样本差异的贡献率为25.99%；且第一主坐标将X处理与Y处理分离。表明‘M218’和‘M240’两者的群落相似度有显著差异（图3）。

图3 基于Unifrac距离PCoA分析

2.3 群落根际微生物功能预测

基于COG数据库PICRUSt2功能预测结果表明，25个功能基因家族中除去S类（未知功能），E类（氨基酸转运和代谢）、C类（能量产生和转换）、M类（细胞壁、细胞膜和膜结构的生物合成）、J类（翻译、核糖体结构和生物发生）丰度值占比较高（图4）。在这些功能基因家族中，X处理比Y处理丰度值较高，说明种植小米辣‘M218’相较‘M240’其根际细菌群落具有较高的生命活动，对根际细菌群落的生命活动具有诱导和促进作用。

图4 细菌菌群COG功能预测

3 讨论

根际微生物作为植物根际生态系统的参与者，在能量代谢、生物群落构建、生态系统稳定、协同植物生长发育、环境适应机制、抗病虫害等方面发挥重要作用［8］。研究表明，不同基因型品种的作物对根系微生物组成有一定的影响。如李增强等［9］通过磷脂脂肪酸（PLFA）联合13CO2标记技术研究不同玉米品种的根际微生物群落结构发现，相较于陕丹8806玉米品种，郑丹958玉米品种的根际细菌和真菌的PLFA-C含量显较高。Marques等［10］发现，相较于高淀粉基因型马铃薯，低淀粉基因型马铃薯根际环境中鞘脂菌属（Sphingobium）、Pseudomonas、不动杆菌属（Acinetobacter）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）和金黄杆菌属（Chryseobacterium）的相对丰度显著增加。

课题组通过对两个不同基因型小米辣品种根际细菌群落分析发现，从门水平结构组成上看，第一大优势菌群是变形菌门（Proteobacteria），其次是拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteriaz）。属水平下，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）是第一大优势菌属，但‘M218’的丰度（14.88 %）高于‘M240’（7.11 %）。虽然在α多样性分析中两者间无显著差异，但在PCoA分析中，两个小米辣品质对其根际微生物群落组成和物种丰度存在着一定影响差异。表明‘M218’和‘M240’根系分泌物可能对其根际土壤细菌群落结构多样性没有显著的影响，但在群落丰度上影响显著。可能是品种间根系分泌物中次生代谢产物（主要包括糖类、氨基酸、有机酸和黄酮类等）的浓度有明显差异［11］引起的。这与前人结果一致，种植作物本身通过根系分泌物的浓度和种类改变根际土壤微生物群落结构、优势菌属及物种丰度［12-13］。

基于COG数据库预测表明，小米辣‘M218’样本功能丰度明显高于‘M240’，其次在新陈代谢方面如氨基酸代谢（amino acid metabolism）和碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）丰度值明显较高，说明小米辣‘M218’可能对其根际细菌群落的生命活动具有较强诱导和促进作用，这可能是品种间基因差异所致，不同基因型植物在生物合成代谢途径、运输和分解中存在差异，这导致其相关分泌物的种类和浓度也存在显著差异，从而间接对根际微生物活动产生一定的调控影响［14］。现有研究表明，碳水化合物、氨基酸、黄酮类和酚酸类等物质均可对根际微生物群落组成产生显著影响，是影响根际微生物群落形成的驱动力［15-16］。Liu等［17］研究发现，花生根系分泌物中的苯甲酸可增加根际土壤中伯克霍氏菌（Burkholderiaspp.）的相对丰度。试验中小米辣‘M218’为地方原始野生品种，而‘M240’是通过人工选育出的栽培品种。在育种进程中，为了得到某些既定的育种目标，使得一些物种特有的基因被筛选而逐步丢失，导致其多样性降低，某些代谢调控途径缺失等［18］。这是否是导致人工选育出的栽培品种根际细菌群落及功能丰度值较低的原因还需要进一步研究。因此下一步可对根系分泌物进行检测，分析其中种类和浓度差异，并通过合成调控路径寻找相关的基因，为本地辣椒特有基因挖掘、特有微生物介导作物生长、耕作土壤生态改良等提供研究基础。

4 结论

综上，本地小米辣‘M218’与人工选育的品种‘M240’相比，其根际细菌群落丰度和功能基因丰度存在显著的差异。这可为地方品种选育、挖掘野生小米辣特有基因功能、小米辣生长与微生物协同机制、指示微生物功能研究起到积极作用。